Lokale Ultraschall-vermittelte Cytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.11.2014 bis 31.10.2015

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1. Zielsetzung
Ziel des vorliegenden Projektes ist es die Wirksamkeit und Selektivität der Chemotherapie von Tumorerkrankungen, insbesondere von Hirntumoren, zu verbessern indem Zytostatika in Microbubbles eingekapselt werden die lokal durch fokussierten Ultraschall zum Platzen gebracht werden so daß der Wirkstoff nur im Tumorgewebe freigesetzt wird während eine systemische Aktivität unterbunden ist. 2. Methoden Die Microbubbles sollen nach etablierten Methoden hergestellt und zunächst als sogenannte Dummys (ohne Zytostatika-Beladung) umfassend auf Stabilität, Größen-verteilung und Löslichkeit untersucht werden. Gängige Methoden dafür umfassen unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS) sowie die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie. Wichtige Parameter, die dabei ermittelt werden sollen sind der Einfluß von pH-Wert, Umgebungstemperatur und Licht sowie wiederholter Einfrier-/Auftau-Zyklen und Scherkräfte durch Schütteln bzw. Zentrifugieren auf die Integrität der Bubbles. Weiterhin sollten neue Wirkstoffkandidaten auf der Basis bekannter bioaktiver Platin-Verbindungen hergestellt werden die besonders einfach mit stark hydrophoben Gruppen für die Verankerung in der inneren Microbubble-Membran geeignet sind.
Auf der Basis dieser Daten soll dann in weiteren Projektschritten, für die aktuell eine DFG-Sachbeihilfe beantragt ist, zunächst das toxikologische Profil der Microbubbles mit und ohne Beladung sowie der nach Ultraschall-vermittelter Ruptur verbleibenden Bubble-Bausteine untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei vor allem der Immunokompatibilität dieser mikroskaligen Systeme gelten. Darauf aufbauend sind dann erste in vivo-Studien geplant. Neben einer Demonstration der Wirkstoff-Freisetzung durchUItraschall im lebenden Modellorganismus ist es hier insbesondere auch das Ziel,Bildgebungsmethoden zur in vivo-Visualisierung und zum Tracking der Microbubbles undihrer Bestandteile zu etablieren. 4. Ergebnisse
4.1 Herstellung und Charakterisierung der Microbubbles In der ersten Projektphase seit dem 01.03.2014 wurde im Labor von Prof. Schatzschneider zunächst die Herstellung mit Octafluorpropan gefüllter Microbubbles etabliert wobei das verwendete Verfahren hier nocheinmal in Abb. 1 gezeigt ist, für die weiteren experimentellen Details wird auf den vorherigen Bericht verwiesen. Abb. 1: Verwendete Methode zur Herstellung der Microbubbles (nach: X. Shuai et al. Int. J. Nanomedicine 2012, 7, 895–904). Die Microbubbles können mittlerweile sehr zuverlässig hergestellt werden, wobei der
Prozess im Bezug auf Größenverteilung und Langzeitstabilität optimiert wurde. Als kritisch stellte sich dabei interessanterweise insbesondere die initiale Filmherstellung heraus. Durch Anfärbung der Bubbles mit 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiIC18) konnten sehr gute Ergebnisse bei der Analyse mittels Fluoreszenzmikroskpie erzielt werden, die im Tumorbiologie-Labor der Neurochirurgischen Klinik und Poliklinik des Universitätsklinikums Würzburg (PD Dr. Carsten Hagemann) durchgeführt werden und gegenüber einfachen lichtmikroskopischen Untersuchungen ein deutlich verbessertes Bild ergeben. In Abb. 2 ist eine solche repräsentative Aufnahme gezeigt aus der vor allem die enge Größenverteilung hervorgeht. Abb. 2: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme mit DiIC18 angefärbter Microbubbles. 4.2 Zytotoxizitätsuntersuchungen an Glioblastom-Zellen Im Labor von Dr. Hagemann sind mittlerweile die Assays etabliert um die Zytotoxizität der verschiedenen Bubble-Komponenten sowie des Wirkstoffs mit und ohne Einschluß in die Microbubbles zu untersuchen. Dafür kommt der metabolische MTT-Assay zum Einsatz, der auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumfarbstoffs beruht, welcher von lebenden Zellen mit aktiven Mitochondrien zu einem blau-violetten Formazan reduziert wird. Die Stärke der Färbung korreliert dabei mit der Zahl der lebenden Zellen und nimmt mit der zytotoxischen Wirkung einer applizierten Substanz konzentrationsabhängig ab.
Tests mit zwei Platinverbindungen, dem etablierten Antitumor-Wirkstoffs Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2) und dem bekanntermaßen inaktiven Kaliumtetrachloroplatinat (K2[PtCl4]) ergaben die erwarteten Ergebnisse und zeigen die Funktionsfähigkeit des Assays an. In einem zweiten Schritt wurden dann die Lipidbausteine der Microbubbles getestet um, obwohl erwartet, deren Unbedenklichkeit auch experimentell zu verifizieren. Im Labor von Prof. Schatzschneider arbeitet Frau Mawamba zur Zeit an der Herstellung neuer Platin-basierter Wirkstoffkandidaten mit langen, hydrophoben Alkylketten die eine Integration in die Bubble-Membran ermöglichen sollen. Erste Verbindungen stehen mittlerweile für die biologischen Tests bereit.
Bis zum Jahresende soll nun ein Verfahren zur Beladung der Microbubbles mit dem organischen Wirkstoff Temozolomid etabliert werden, was insbesondere die Entwicklung einer Method zur HPLC(high-pressure liquid chromatography)-Bestimmung dieser Substanz in der Bubble-Phase und der überstehenden Lösung erfordert, während die Anlagerung Metall-basierten Wirkstoffkandidaten direkt über Messung des Platingehalts mittels ICP-MS oder AAS verfolgt werden soll. 4.3 DFG-Antrag Basierenden auf den mit Hilfe der Förderung durch die Jörg-Bernards-Stiftung durchgeführten Vorarbeiten konnte am 30.04.2015 der Antrag auf Sachbeihilfe für das Projekt "Lokale Freisetzung zytotoxischer Wirkstoffe zur Behandlung maligner Gliome unter Verwendung von fokussiertem Ultraschall" bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) eingereicht werden. Projektverantwortliche sind PD Dr. Carsten Hagemann (Neurochirurigsche Klinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Würzburg) und Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider (Institut für Anorganische Chemie, Universität Würzburg) mit PD Dr. Mario Löhr und Prof. Dr. Volker Sturm als weiteren Mitantragstellern. In insgesamt vier Arbeitspaketen (work packages, WPs) sollen über 36 Monate Laufzeit die Bubble-Herstellung und Beladung mit Wirkstoffen (WP1), die Bubble-Stabilität und Ultraschall-vermittelte Wirkstofffreisetzung (WP2) sowie die biologische Wirkung mit und ohne Ultraschall auf Glioblastom-Zellen in in vitro 2D- und 3D-Zellkulturen (WP3+4) untersucht werden. Die Gutachten liegen der DFG mittlerweile vor und mit einer Entscheidung des zuständigen Fachkollegiums wird im 1. Quartal 2016 gerechnet. 4.4 Ausblick Mit der erfolgreichen und reproduzierbaren Herstellung der Microbubbles sowie der Etablierung der in vitro-Zytotoxizitätsassays stehen nun prinzipiell alle Materialien und Methoden zur Verfügung um die differentielle Wirkung der beladenen Microbubbles mit und ohne Ultraschallwirkung zu untersuchen.
Wesentliches Hindernis für den weiteren Projektfortschritt ist aktuell jedoch des Fehlen eines Ultraschall-Transducers mit Kosten in Höhe von ca. € 33.500,- (Angebot des Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik IBMT in St. Ingbert, Preis inkl. MwSt.). Die Mittel für dieses essentielle Gerät sind zwar in dem DFG-Antrag enthalten (vide supra), werden aber selbst bei positiver Begutachtung vermutlich frühestens Mitte 2016 zur Verfügung stehen. Zwar soll in der Zwischenzeit versucht werden die Microbubbles durch andere Mechanismen zum Platzen zu bringen (Hitzeeinwirkung, starke Scherkräfte), dabei ist jedoch mit negativen Einflüsse auf den eingeschlossenen Wirkstoff, insbesondere bei erhöhten Temperaturen, zu rechnen und das Ziel des Projekts ist ja die zytotoxische Wirkung durch fokussierten Ultraschall zu lokalisieren.
Weiterhin wünschenswert wäre ein einfaches, gebrauchtes klinisches Ultraschallgerät, über das die Microbubbles über ihren differentiellen Kontrast relativ zum Medium direkt nachgewiesen werden könnte um ihre Stabilität in Modellsystemen für Blutgefäße untersuchen zu können. 5. Ausgaben
Für das Projekt standen auf Antrag vom 08.12.2014 im Berichtszeitraum zuzüglich der Deckung der restlichen Personalausgaben Mittel in Höhe von insgesamt € 7.500,- zur Verfügung, wobei von diesem Ansatz € 6.500,- für Sachkosten und € 1.000,- für Reisemittel vorgesehen waren. Als verantwortliche Mitarbeiterin ist seit 01.03.2014 Frau Vivane Mawamba (Bachelor Chemie Universität Jaunde I, Kamerun; Master Chemie TU Clausthal) nach TV-L 13 50% beschäftigt, die weiterhin herausragende Arbeit leistet. Besonders hervorzuheben ist dabei die ausgezeichnete Zusammenarbeit mit den Mitarbeiter/inne/n im Labor von Herrn PD Dr. Hagemann, in dem Frau Mawamba mittlerweile regelmäßig mikroskopische Untersuchungen zur Stabilität der Microbubbles durchführt. Frau Mawamba wird seit dem 01.03.2015 über eine Hausstelle aus den Berufungsmitteln von Herrn Prof. Schatzschneider finanziert, aus der ihre Stelle bis zur einer Promotionshöchstdauer von vier Jahren weiterfinanziert wird. Im Bereich der Sachmittel wurden im wesentlichen Basischemikalien beschafft (Sigma-Aldrich, Serva und Strem: € 2.595,94-). Zudem wurden einige Ersatzteile für defekte Laborgeräte benötigt (Evoqua und HekaTech: € 1.016,86-). Weitere sächliche Auslagen an die Firma MRC Systems GmbH in Heidelberg (€ 4.424,35-) werden von Prof. Sturm separat nachgewiesen. Reisekosten fielen in 2015 nicht an da die Teilnahme von Frau Mawamba und Prof. Schatzschneider am "European Molecular Imaging Meeting" (EMIM) in Tübingen (18. bis 20.03.2015) durch die COST Action TD1004 "Theranostics Imaging and Therapy" finanziert wurde, ebenso wie die Präsentation von Prof. Schatzschneider auf dem COST TD1004 Closing Meeting in Belgrad (10./11.09.2015). Diese Mittel wurden daher zur Deckung des erweiteren Sachmittelbedarfs herangezogen. Insgesamt wird dadurch für den Projektzeitraum 01.11.2014 bis 31.03.2016 ein Fehlbetrag in Höhe von € 4.119,67- erwartet, der im wesentlichen auf die unerwarteten Auslagen für die Fa. MRC Systems zurückzuführen ist. Für einen entsprechenden Ausgleich wären wir sehr dankbar. Würzburg, 08.11.2013 Ulrich Schatzschneider

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Cytostatika-Applikation, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.03. bis 30.11.2014

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1. Zielsetzung Ziel des vorliegenden Projektes ist es die Wirksamkeit und Selektivität der Chemotherapie von Tumorerkrankungen, insbesondere von Hirntumoren, zu verbessern indem Cytostatika in Microbubbles eingekapselt werden die lokal durch fokussierten Ultraschall zum Platzen gebracht werden so daß der Wirkstoff nur im Tumorgewebe freigesetzt wird während eine systemische Aktivität unterbunden ist. 2. Methoden Die Microbubbles sollten nach etablierten Methoden hergestellt und zunächst als sogenannte Dummys (ohne Cytostatika-Beladung) umfassend auf Stabilität, Größen-verteilung und Löslichkeit untersucht werden. Gängige Methoden dafür umfassen unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS) sowie die Lichtmikroskopie. Wichtige Parameter, die dabei ermittelt werden sollen sind der Einfluß von pH-Wert, Umgebungs-temperatur und Licht sowie wiederholter Einfrier-/Auftau-Zyklen und Scherkräfte durch Schütteln bzw. Zentrifugieren auf die Integrität der Bubbles. Weiterhin sollten neue Wirkstoffkandidaten auf der Basis bekannter bioaktiver Platin-Verbindungen hergestellt werden die besonders einfach mit stark hydrophoben Gruppen für die Verankerung in der inneren Microbubble-Membran geeignet sind. Auf der Basis dieser Daten soll dann in weiteren Projektschritten, für die aktuell eine DFG-Förderung beantragt wird, zunächst das toxikologische Profil der Microbubbles mit und ohne Beladung sowie der nach Ultraschall-vermittelter Ruptur verbleibenden Bubble-Bausteine untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei vor allem der Immunokompatibilität dieser mikroskaligen Systeme gelten. Darauf aufbauend sind dann erste in vivo-Studien geplant. Neben einer Demonstration der Wirkstoff-Freisetzung durch UItraschall im lebenden Modellorganismus ist es hier insbesondere auch das Ziel, Bildgebungsmethoden zur in vivo-Visualisierung und zum Tracking der Microbubbles und ihrer Bestandteile zu etablieren. 4. Ergebnisse Das Projekt startete am 01.03.2014 mit der Einstellung von Frau Viviane Mawamba als Doktorandin nach TVL13 50%. Sie verfügt über einen Hintergrund aus dem Bereich der bioabbaubaren Polymere und hat sich seitdem hervorragend in die Arbeitsgruppe eingefügt. Nach einer eingehenden Literaturrecherche wurde entschieden für die Synthese der Microbubbles die thin-film hydration-sonication-Method zu verwenden (Abb. 1).1 Dabei wird eine Phospholipid-Mischung (DPPC, DPPA und PEG2000-DSPE) in Chlorofom gelöst und nach Abdampfen des organischen Lösemittels ein Lipidfilm gebildet. Dieser wird dann bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (beschafft aus Projektmitteln) hydratisiert, wobei sich Liposomen bilden. Eine Suspension dieses Materials wird dann in einem Zentrifugen-röhrchen unter einer Atmosphäre von Octafluorpropan als Füllgas mit einem Ultraschall- Homogenisator (ebenfalls beschafft aus Projektmitteln) beschallt, wobei sich die Microbubbles bilden. Durch differentielle Zentrifugation können die verschiedenen Bubble- Fraktionen dann getrennt werden.2 Die Charakterisierung erfolgt im eigenen Labor mittels Lichtmikroskopie mit einer USB-Kamera zur Dokumentation sowie durch Dynamische Lichtstreuung (DLS) in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Anke Krüger ( Institut für Organische Chemie, Universität Würzburg). Abb. 1: Verwendete Methode zur Synthese der Microbubbles (nach: X. Shuai et al. Int. J. Nanomedicine 2012, 7, 895–904). Der Beginn der Microbubble-Herstellung wurde dabei durch die unerwartet lange Lieferzeit für die Lipide (bezogen über Distributor Otto Nordwald von Avanti Polar Lipid, Alabaster, Alabama, USA) und das Octafluorpropan (Linde Spezialgase) erheblich verzögert. Durch regelmäßiges Verwiegen insbesondere der Gasflasche wird jedoch der Verbrauch an Ausgangsmaterialien nunmehr kontinuierlich fortgeschrieben so daß in Zukunft frühzeitig Ersatz bestellt werden kann. Für die Herstellung der Microbubbles unter Octafluorpropan-Atmosphäre wurde von Frau Mawamba ein Aufbau konstruiert der den Verbrauch an Lipiden wie an Füllgas minimiert. Bereits im ersten Versuch konnten Microbubbles erhalten werden die mit Lichtmikroskopie charakterisiert wurden. Mit dem vorhandenen Gerät (VisiScope BL224 PI mit 10 Megapixel USB-Kamera VisiCam) können dabei Bubbles bis zu einem Durchmesser von etwa 1 μm sicher identifiziert werden (Abb. 2a), für die noch kleineren Nanobubbles (d < 1 μm) reicht das Auflösungsvermögen unseres Mikroskops jedoch nichtmehr aus. Hier soll im neuen Jahr nach Markierung der Bubbles mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Dil, 1,1′-Dioctadecyl- 3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat) ein kürzlich im Labor von Dr. Carsten Hagemann (Neurochirurgische Klinik und Poliklinik, Universitäts-klinikum Würzburg) installierstes konfokales Fluoreszenzmikroskop mit wesentlich höherer Auflösung zur Charakterisierung herangezogen werden. Als kritischer Parameter für die Isolierung der Microbubbles mit einer möglichst reproduzierbaren und engen Größenverteilung stellte sich dabei der Zentrifugationsschritt heraus. Weiterhin ergaben Messungen daß es bei der Ultraschall-Applikation im Homogenisator abhängig von Dauer und Amplitude zu einem erheblichen Energieeintrag in die Suspension kommt. So steigt bei einer Ultraschall-Applikation für nur 5 min bei einer Amplitude von 50 % die Temperatur um fast 25 °C von Raumtemperatur auf über 50 °C an. Da die Bubbles abhängig von der Temperatur "reifen" ist eine sorgfältige Kontrolle auch dieses Parameters gefragt. Möglicherweise spielt dieser auch bei dem Zentrifugations-schritt eine Rolle, da die verwendeten Rotoren über keine Temperaturkontrolle verfügen, eine Messung ist jedoch schwierig. Abb. 2: a) Lichtmikroskopische Aufnahme der ersten im Rahmen des Projekts hergestellten Microbubbles (40fache Vergrößerung) und b) Cisplatin-Derivat mit C16-Alkylketten als Membran-affines Wirkstoffderivat. Parallel zur Bubble-Herstellung und Charakterisierung hat Frau Mawamba auch damit begonnen, Derivate des etablierten Antitumor-Wirkstoffs Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2) herzustellen die über langkettige Alkylgruppen verfügen um so eine hohe Membran-Affinität sicherzustellen (Abb. 2b). Trotz anfänglicher erheblicher Verzögerung die durch die lange Lieferzeit der benötigten Materialien bedingt war ist das Projekt jedoch insgesamt sehr gut gestartet. Die ein-gestellte Mitarbeiterin hat alle Erwartungen sogar noch übertroffen, sich hervorragend in das Projekt eingearbeitet und auch sehr gut in die Arbeitsgruppe eingefügt. Es wurde eine Aufbau für die Herstellung der Microbubbles konstruiert und kritische Parameter für eine reproduzierbare und enge Größenverteilung ermittelt. Die ersten hergestellten Bubbles zeigen den gewünschten Durchmesser im unteren Mikrometer-Bereich und werden nun für eine weitergehende Charakterisierung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie mit einem Farbstoff markiert. Außerdem wurden erste Schritte hin zu Membran-affinen metallbasierten Wirkstoffkandidaten unternommen. Somit konnten alle wesentlichen Projektziele erreicht werden. In der nun folgenden Projektphase steht insbesondere die Etablierung der Zellkultur-Assays im Vordergrund sowie die Integration eines Systems für die Ultraschall-vermittelte Ruptur der Microbubbles um deren differentielle Wirkung auf Tumorzellkulturen mit und ohne Ultraschall-Einwirkung untersuchen zu können. 5. Ausgaben Für das Projekt standen auf Antrag vom 08.11.2013 Mittel in Höhe von insgesamt € 37.500,- zur Verfügung, wobei von diesem Ansatz € 30.000,- für Personalkosten und € 7.500,- für Sachmittel vorgesehen waren. Als Mitarbeiterin in dem Projekt wurde zum 01.03.2014 Frau Vivane Mawamba (Bachelor Chemie Universität Jaunde I, Kamerun; Master Chemie TU Clausthal) eingestellt die mit einem Hintergrund aus dem Bereich bioabbaubare Polymere über den passenden Hintergrund für das Vorhaben verfügt und sich seitdem hervorragend in die Arbeitsgruppe eingefügt hat. Die Personalkosten für die Monate März bis Oktober 2014 beliefen sich auf € 16.701,20- was bei einer Laufzeit von acht Monaten einem Betrag von € 2.087,65- pro Monat entspricht. Für die gesamte Projektdauer werden daher Personalausgaben in Höhe von € 25.051,80- zzgl. der Jahressonderleistung in Form von Weihnachtsgeld erwartet und der Personalansatz somit vermutlich geringfügig unterschritten. Frau Mawamba wird ab 01.03.2015 über eine Hausstelle aus den Berufungsmitteln von Herrn Prof. Schatzschneider bis zur einer Promotionshöchstdauer von 4 Jahren weiterfinanziert werden. Im Bereich der Sachmittel waren für die Herstellung der Microbubbles insbesondere die Beschaffung eines Schüttelinkubators (VWR: € 1.431,57-) und eines Ultraschall-Generators (Zinsser Analytics: € 3.263,81-) erforderlich. Weitere wesentliche Positionen stellten die Lipide für das Microbubble-Hüllmaterial (Avanti Polar Lipids durch Distributor Otto Nordwald: € 733,04-) und als Microbubble-Füllmaterial Octafluorpropan (Linde Spezialgase: € 956,28-) dar. Der Restbetrag verteilte sich dann auf weiteres Laborkleingerät sowie Basischemikalien (VWR, Sigma und Hartenstein: € 1.065,00-). Weitere sächliche Auslagen an die Firma MRC Systems GmbH in Heidelberg (€ 6.417,88-) werden von Prof. Sturm separat nachgewiesen. Reisekosten fielen in 2014 nicht an da die Teilnahme von Frau Mawamba an dem COST Action TD1004 "Theranostics Imaging and Therapy" Annual Meeting in Istanbul (03. und 04.10.2014), an dem sie sich einen Vortrag zum Thema "Microbubbles as drug carriers" beteiligt hat, und der 3. NanoFar Autumn School an der Université catholique de Louvain in Brüssel (20.–24.10.2014) dankenswerterweise von COST TD1004 erstattet wurden. Diese Mittel wurden daher zur Deckung des erweiteren Sachmittelbedarfs herangezogen. Insgesamt wird so für die Projektlaufzeit 01.03.2014 bis 28.02.2015 ein Fehlbetrag in Höhe von € 1.419,38- zzgl. des Betrags für die Weihnachtssonderzahlung, voraussichtlich insgesamt € 2.500,- erwartet, der im wesentlichen auf die unerwarteten Auslagen für die Fa. MRC Systems zurückzuführen ist. Für einen entsprechenden Ausgleich wären wir sehr dankbar. Würzburg, 08.11.2013 Ulrich Schatzschneider

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Im Tumorbiologie-Labor des Universitätsklinikums Würzburg in Kooperation mit dem Institut für Anorganische Chemie der Universität Würzburg Einen Einblick in typische Arbeitsschritte im Tumorbiologie-Labor der Universität Würzburg geben die beiden Fotos oben. Links analysiert der Biochemie-Student Wilfrid Dzokou auf dem Laptop Wachstumskurven von Krebszellen für seine Bachelorarbeit während rechts die Technische Laborassistentin Elisabeth Karl das xCELLigence-Gerät mit neuen Zellkulturplatten belädt. Anschließend wird die Tür des Brutschranks geschlossen um die Zellen unter konstanten Bedingungen, insbesondere bei 37 °C wie im menschlichen Körper, wachsen zu lassen. Unten das Projektteam (von links nach rechts): Viviane Mawamba, Doktorandin am Institut für Anorganische Chemie, Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider, Leiter chemische Synthese und Microbubble-Herstellung, Priv.-Doz. Dr. Carsten Hagemann, Leiter des Tumorbiologie-Labors, Priv.-Doz. Dr. Mario Löhr und Prof. Dr. Volker Sturm, Leitung des ärztlichen Teams. Elektronisch angesteuerte Transducer-Elemente erlauben die Fokussierung des Ultraschalls auf den Tumor Durch sogenannte "phased array transducer", wie sie auch in der modernen Radartechnik zum Einsatz kommen, kann der Ultraschall alleine durch elektronische Ansteuerung der Transducer-Elemente in bestimmte Richtungen gelenkt werden. Für therapeutische Anwendungen ist daher geplant die Transducer in einem Helm zu fixieren so daß ihre Anordnung relativ zum Tumor auch bei Kopfbewegungen des Patienten konstant bleibt. Anhand von Tomographie-Bildern wird dann festgelegt welche Gehirn-Bereiche wie lange und wie intensiv dem fokussierten Ultraschall ausgesetzt werden sollen um die im Blutstrom zirkulierenden Microbubbles zum Platzen zu bringen und den enthaltenen Wirkstoff lokal freizusetzen. Dabei werden auch Unregelmäßigkeiten in der Struktur des Schädelknochens berücksichtigt.Anders als beispielsweise radioaktive Strahlung ist Ultraschall gesundheitlich unbedenklich und hat keinen schädlichen Einfluss auf das ebenfalls durchstrahlte gesunde Gewebe. Der verwendete Ultraschall ist dabei sehr ähnlich dem schon seit langem z.B. bei Schwangerschaftsuntersuchungen verwendeten.Die Abbildung zeigt die Aufnahme eines Gehirntumors (weiß umrandete Fläche in der oberen linken Kopfhälfte) mit der schematischen Darstellung zweier Transducer-Elemente und unterschiedlich abgestrahltem Ultraschall. Ultraschall-Behandlung bringt die Microbubbles zum Platzen und verwandelt die milchige Suspension in eine klare Lösung Ultraschall bringt die Microbubbles zum Platzen Die Abbildung zeigt eine Suspension der Microbubbles in wässriger Lösung (links) vor und (rechts) nach Beschallung mit Ultraschall. Die Bubbles sind zu klein um sie ohne Mikroskop mit dem bloßen Auge erkennen zu können, ihre Lösungen erscheinen jedoch milchig, ganz wie bei Kuhmilch, die ebenfalls aus Fetttröpfchen in Wasser besteht. Durch die Einwirkung des Ultraschalls zerplatzen die Bubbles und zerfallen in ihre Bestandteile, die zu klein sind um noch Licht zu streuen. Daher ist die Ultraschall-behandelte Lösung klar. Mit einem Farbstoff markierte Microbubbles leuchten im Mikroskop und lassen die Bläschen erkennen die 50x kleiner sind als der Durchmesser eines menschlichen Haars. Die Abbildung zeigt Microbubbles in deren Hülle ein Fluoreszenz-Farbstoff eingebettet ist. Dieser beginnt beim Anstrahlen im Mikroskop zu leuchten und macht so die Bläschen sichtbar. Mit einem Durchmesser von nur etwa einem Mikrometer (1 µm) sind die Microbubbles etwa 50x dünner als der Querschnitt eines menschlichen Haars und damit so klein daß sie auch durch die Kapillargefäße des menschlichen Blutkreislaufs wandern können ohne diese zu verstopfen. Die Hülle der Microbubbles besteht aus Lipid-Bausteinen ähnlich der Wand menschlicher Zellen und ist daher ebenso wie das Füllgas gesundheitlich unbedenklich. Nach dem Zerplatzen der Bubbles wird das ohnehin nur in geringsten Mengen aufgenommene Füllgas vermutlich über die Lungen wieder abgeatmet. In die lipophile, fettartige Hülle der Microbubbles können medizinische Wirkstoffe eingelagert werden, die so vor unspezifischen negativen Wechselwirkungen mit dem Körper geschützt sind, was die bekannten Nebenwirkungen einer Chemotherapie lindern soll. Erst im Tumor soll das Medikament dann durch Ultraschall-vermitteltes lokalisiertes Zerplatzen der Bubbles freigesetzt werden und seine Wirkung entfalten. Microbubbles und ihre Bausteine sind biologisch unbedenklich, Platin-basierte Wirkstoffe töten dagegen Krebszellen ab Die biologische Wirkung einer chemischen Verbindung kann durch den MTT-Assay gemessen werden. Dieser beruht darauf daß lebende Zellen einen gelben Farbstoff zu einer violetten Verbindung reduzieren. Je weniger stark violett eine Zellkultur ist desto weniger lebende Zellen enthält diese, was in der Regel auf einer Skala von 0 bis 1 (entsprechend 0–100%) relativ zu unbehandelten Zellen angeben ist. Die Abbildung zeigt a) die vernachlässigbare Wirkung der Lipid-Bausteine (DPPA, DPPC, DSPE-PEG) der Microbubbles relativ zu eine Kontrollprobe sowie b) die gewünschte Inaktivität der intakten Microbubbles bis zu einer Millionen Bläschen pro Milliliter. Demgegenüber führt eine Behandlung mit c) Cisplatin, ein in der Chemotherapie insbesondere von Hodenkrebs sehr erfolgreich eingesetzter Wirkstoff, zu einer signifikanten Reduktion der Zahl der lebenden Zellen. Da Cisplatin nicht lipophil genug ist um in die Hülle der Microbubbles eingebaut zu werden wurde d) eine weitere experimentelle Substanz VM-046-01 hergestellt die über einen seifenartigen "Schwanz" verfügt mit dem sie sich an die Bubbles anlagern soll und die ebenfalls wirksam gegen die Hirntumorzellen ist. Projektziele: Die Untersuchungen wurden bisher ausschließlich aus Zuwendungen der Jörg Bernards-Stiftung, sowie aus Eigenmitteln der Klinik für Neurochirurgie des Universitätsklinikums und des Instituts für Anorganische Chemie der Universität Würzburg finanziert. Die oben skizzierten Zwischenergebnisse sind positiv. Die für den bisherigen Projektverlauf avisierten Ziele sind erreicht. Wir sehen damit gute Chancen, in den nächsten 2 bis
3 Jahren eine zumindest im Tierversuch einsetzbare Methodik zur verbesserten, d.h. lokalen Chemotherapie bösartiger Hirntumoren, sowie im nächsten Schritt auch bestimmter anderer Krebserkrankungen wie Mamma- und Prostatakarzinomen zu entwickeln. Dier hierzu notwendigen chemischen und biologischen Experimente können mit überschaubaren Mitteln realisiert werden. Dies schließt die Entwicklung und Anwendung einfacher, allerdings nur in Laborversuchen verwendbarer Ultraschall-Systeme ein. Ein wesentliches Zwischenziel war die aus Stiftungsmitteln finanzierte Konstruktion des bislang verwendeten Ultraschall-Systems, das für die weiterführenden Versuche noch modifiziert werden muss. Ziel ist der erfolgreiche Abschluss der chemischen und biologischen Entwicklungen, d.h. die Demonstration der erhöhten Wirksamkeit und Verträglichkeit des neuen Verfahrens. Nach der Ablehnung des vom DKFZ Heidelberg koordinierten interdisziplinären Projektes zur Entwicklung eines klinisch einsetzbaren Ultraschall-Systems ist es sehr fraglich, ob dieses Ziel erreichbar ist. Wir werden diese Problematik mit den Projektteilnehmern (insbesondere DKFZ Heidelberg und Fraunhofer Institut St. Ingbert und Kaiserslautern) diskutieren. Sollte dieses Projekt nicht finanzierbar sein, müsste das von uns in Würzburg entwickelte Verfahren industriellen Partnern zur Verfügung gestellt werden, um die Einführung in die Klinik zu ermöglichen. Für eine weitere Förderung des Würzburger Projektes wären wir sehr dankbar. Eine Abschätzung des Finanzbedarfes werden wir in Kürze nachreichen.

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Beinahe täglich erfährt man von „neuen“ Vorkommnissen im Gehirn. Sei es der Ort für die romantische Liebe, Aggression oder Aversion... Wie bei einem Bericht über angesagte Urlaubsregionen möchte mancher die Örtlichkeiten etwas näher kennenlernen und sich mit den Gegebenheiten näher vertraut machen. Nun ist es im Gehirn schwieriger, sich zurechtzufinden und die Berichte einzuordnen. Die „Landkarten“ des Gehirns lassen sich nicht wie Straßenkarten ausbreiten sondern bilden ein dreidimensionales kompliziertes Konstrukt. Die Regionen des Gehirns auf zweidimensionalen Atlastafeln verlässlich abzubilden erinnert an die Quadratur des Kreises. Eine Forschergruppe aus Düsseldorf hat dieses Problem offenbar gelöst. Sie stellen einen neuen Atlas vor, der in einer großen Serie von Hirnschnitten die Architektur des Gehirns in ungewohnter Auflösung darstellt. Was wie Fotografien von zell- und fasergefärbten Schnitten imponiert, sind in Wirklichkeit Darstellungen mathematisch bearbeiteter Schnitte, die an ein international verwendetes Standardgehirn angeglichen wurden. Dies wurde erreicht, indem aus sehr vielen Einzelschnitten ein dreidimensionales Gehirn geschaffen wurde, das wiederum an den „Mittelwert“ von Einzelgehirnen angepaßt wurde. Das „Mittelwert“-Gehirn wurde von einer Forschergruppe im Montreal Neurological Institute aus 152 MRI Datensätzen entwickelt und kostenfrei weltweit verfügbar gemacht. Es bildet gegenwärtig den Goldstandard für die Zuordnung von anatomischen und funktionellen Daten in individuelle MRI-Datensätze. Die Besonderheit des Atlases gegenüber zahlreichen vergleichbaren internationalen Initiativen besteht darin, dass die Strukturen des menschlichen Gehirns in bisher unerreichter Auflösung und Ausführlichkeit abgebildet und in ein „generalisiertes Hirnmodell“ transformiert wurden. Der neue Atlas verbindet also die hochaufgelöste
Anatomie der Serienschnitte mit dem „allgemeinen“ radiologischen Mustergehirn. Dadurch wird die Grundlage für eine direkte Vergleichbarkeit individueller Gehirne geschaffen. Hierin können anhand der standardisierten Koordinaten (Voxel) die „neuen“ Vorkommnisse“ zugeordnet und mit bereits vorliegenden Daten abgeglichen werden. Die gesamte Hirnrinde wird linear repräsentiert, so dass alle relevanten Ergebnisse in einer Tabelle mit entsprechender Ausdehnung und Wahrscheinlichkeitsgrad abgebildet
werden können. Ein Problem hinsichtlich der Vergleichbarkeit ergibt sich allerdings wegen des komplizierten, gewundenen und höchst individuellen Rindenmusters des Gehirns. Auch hierzu wurde eine (neue) Lösung gefunden: Die gesamte Hirnrinde wurde mathematisch abgetrennt und wie ein Band in eine gerade Linie gebracht (Abbildung). Da hierbei die Koordinatenpunkte „mitgeführt“ werden, bleibt deren Lage, auf das Gehirn bezogen, erhalten. Die gesamte Rindenregion läßt sich dadurch linear abbilden und die jeweils charakterisierten Regionen wie in einer Tabelle mit Ausdehnung und Wahrscheinlichkeitsgrad eintragen.Werden alle relevanten Ergebnisse in dieser Tabelle repräsentiert, können erstmals die veröffentlichtenBefunde ortsgenau im Atlas in ihrer Struktur-Funktionsbeziehung dargestellt werden. Weiterreichende Möglichkeiten als sie der gedruckte Atlas bieten kann, ermöglicht das dreidimensionale Modell, das dem Atlas zugrunde liegt. Dieses Modell kann mit jedem MRT-Datensatz einer Einzelperson verrechnet und zur Darstellung der Struktur dieses Gehirns verwendet werden. Diese Sichtbarmachung der Strukturen kann unter Verwendung von z.T. eigenständig entwickelten, selbstlernenden mathematischen Algorithmen vollautomatisch durchgeführt werden. Das Verfahren wurde erfolgreich
zur Verbesserung der Planungsgenauigkeit und zur Auswertung von hirnchirurgischen Eingriffen (Tiefenhirnstimulation) sowie als Interpretationshilfe von (komplizierten) radiologischen MRT-Befunden des Gehirns eingesetzt. Von den vielen Initiativen, die weltweit an Analyse-Tools für die Interpretation des menschlichen Gehirns arbeiten, unterscheidet sich dieses Projekt zum einen durch die Qualität der anatomischen Grundlagen, zum anderen durch die automatischen Berechnungsroutinen.

• Mehrere Jahrzehnte wurde an dem Atlas gearbeitet, um die Ausführlichkeit und Detailgenauigkeit zu erreichen. Bereits die erste Auflage 1996 erhielt den “Medical Science Award” der American Association of Publishers for Professional and Scholarly Publishing (https://proseawards.com/winners/1997-award-winners/#body). In der völlig neuen 4. Auflage wird nun das dreidimensionale „generalisierte Hirnmodell“ repräsentiert.
• Dank der Entwicklung neuer Algorithmen können die anatomischen Informationen in die einzelnen MRI Datensätze von Patienten transformiert und für die automatische Interpretation von Gehirn-Scans verwendet werden.

Eine kurze Darstellung des gedruckten Atlas findet sich unter: atlas.thehumanbrain.info Prof. Dr. Juergen K. Mai und Dr. Milan Majtanik
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
e-mail: mai@uni-duesseldorf.de, milan.majtanik@uni-duesseldorf.de

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Die anatomische Struktur des Gehirns kann mit modernen bildgebenden Verfahren, wie z.B. der Magnetresonanztomographie (MRT), sichtbar gemacht werden (Abb. 1b). Trotzt der Fortschritte in den letzten Jahren kann jedoch nur ein Bruchteil der anatomischen Komplexität des Gehirns mit diesen Verfahren dargestellt werden. Dies wirkt sich erschwerend auf viele Therapieverfahren aus.

Für Tiefenhirnstimulation, ein Therapieverfahren bei dem die Aktivität bestimmter Hirngebiete mit elektrischer Stimulation moduliert wird, ist es außerordentlich wichtig die genaue Position und die 3D Form des zu stimulierende Hirnareals genau zu kennen. Nur dann kann eine optimale Stimulation und damit eine wesentliche Reduktion der Symptome erzielen werden. Dabei müssen oft nur spezielle Teilstrukturen, die mit bloßem Auge kaum bestimmbar sind, stimuliert werden. Bei pathologischen Hirnveränderungen und durch individuelle Variationen kann die genaue Lokalisation von Teilstrukturen sehr erschwert oder fast unmöglich sein. Auch für die Behandlung von pathologischen Hirnveränderungen (Tumore, Demenz, ...) ist es sehr wichtig, präzise zu wissen, wo diese Veränderungen stattfinden, um eine optimale Therapie mit minimalen Nebenwirkungen zu bestimmen.

Um das Problem der fehlenden Details der Hirnanatomie zu lösen, benötigt man eine zusätzliche Quelle für anatomische Information. Dazu kann man auf einen Hirnatlas zurückgreifen. In dieser Arbeit wurde der detaillierteste Atlas des menschlichen Gehirns, der Hirnatlas von Mai, verwendet (Mai et. al., 2008). Der Mai Atlas enthält eine sehr hohe Anzahl von anatomischen Strukturen und deren Unterteilungen, die aus mikroskopischen Untersuchungen von menschlichem post-mortem Gehirnen gewonnen wurden.

In der Abbildung 1 werden beispielhaft die Teilstrukturen der Amygdala, einer für die Verarbeitung von Emotionen wichtige Hirnstruktur, dargestellt. Mit dem neu entwickelten Algorithmus wird der Mai-Atlas (Abb. 1a) hierarchisch, nichtlinear und multimodal auf das Gehirn eines Patienten (Abb. 1b) transformiert. Damit wird die anatomische Information direkt auf dem Gehirn des Patienten sichtbar gemacht (Abb. 1c) und kann für eine 3D-Operationsplanung genutzt werden (Abb. 1d).

Mit dem Algorithmus konnten zwei wesentliche Verbesserungen erarbeitet werden. Erstens, mit der Transformation des Atlasses auf das Patienten-Gehirn wird ein großes Spektrum von anatomischen Details sichtbar gemacht und kann für die Verbesserung der Vorbereitung operativer stereotaktischer Eingriffe am menschlichen Gehirn genutzt werden (A). Zweitens, kann der Transformation-Algorithmus für eine Früherkennung von krankhaften Hirnveränderungen eingesetzt werden (B).

Abbildung 1: Die Anwendung des Atlasses für die Planung einer Tiefenhirnstimulation von Amygdala. (a) Der Atlas von Mai. (b) MRT-Scan des Patienten. (c) Teilstrukturen der Amygdala farbig kodiert. (d) 3D Model der Teilstrukturen der Amygdala zusammen mit einer optimal platzierten Stimulationselektrode.

(A) Verbesserung der Vorbereitung operativer stereotaktischer Eingriffe

Mit der detaillierten anatomischen Information auf dem Patientenhirn kann die Präzision

und die Effektivität der stereotaktischen Eingriffe verbessert werden. Man kann die Wirkung der sichtbaren Anatomie am Beispiel der Tiefenhirnstimulation (im Englischen deep brain stimulation, DBS) veranschaulichen. Die Standardanwendung der Tiefenhirn-stimulation ist die Behandlung der Symptome der nicht medikamentös behandelbaren Parkinson’schen Erkrankung. Dazu wird stereotaktisch eine sehr dünne Elektrode ins Gehirn des Patienten eingeführt. Über diese chronisch implantierte Tiefenhirnelektrode wird ein permanenter, hochfrequenter (> 100 Hz), elektrischer Strompuls appliziert. Die hochfrequente Tiefenhirnstimulation ändert das Muster der neuronalen Aktivität und kann im Zielgebiet zur Unterdrückung der pathologischen neuronalen Aktivität führen. Dies führt zur Unterdrückung vom peripheren Tremor bei Parkinson’schen Erkrankung. Wichtig für die Effektivität der Tiefenhirnstimulation ist eine präzise Platzierung der Tiefenhirnelektrode im Zielgebiet. Liegt die Elektrode nur teilweise oder daneben, reduziert es wesentlich die Wirkung der Stimulation und führt es zu unerwünschten Nebeneffekten.

Ist die präzise anatomische Lokalisation des Zielgebietes während einer Operations-planung mit dem Atlas sichtbar gemacht, so können möglichst viele Stimulationskontakte der Elektrode richtig platziert werden. Bei sehr kleinen und komplizierten Strukturen, wie z.B. bei der Amygdala ist es nicht möglich, die genaue Lage der Teilstrukturen mit bloßem Auge genau zu erkennen. Hier ermöglicht der auf das individuelle Patienten-Gehirn angepasster Atlas eine Operationsplanung in 3D (Abb. 1d). Das Ziel ist, die Elektrode so zu platzieren, dass möglichst viele Stimulationskontakte (Abb. 1d, grauer Pfeil) innerhalb des Zielgebiets liegen und möglichst wenig die benachbarten Strukturen beeinflussen. Je mehr Kontakte in dem Zielgebiet liegen, umso effektiver ist die Wirkung der Stimulation und umso kleiner sind die Nebeneffekte.

Abbildung 2: Früherkennung von Tumoren am Beispiel mit zwei MRT Aufnahmen. Eine frühere MRT Aufnahme (a) wird nichtlinear auf aktuelle MRT Aufnahme (b) transformiert. Die dabei entstehenden Veränderungen können automatisch sichtbar gemacht werden (c). Diese Hirnveränderungen weisen auf mögliche Entstehung eines Tumors hin und können langfristig beobachtet werden.

B) Früherkennung von krankhaften Hirnveränderungen

Eine weitere Anwendung der Software betrifft eine Gruppe von Menschen, die bis heute fast vollkommen vernachlässigt wird. Es sind Menschen, die einen Tumor haben aber sie wissen es nicht. Es wird geschätzt, dass es über 100000 Menschen in Deutschland gibt, für die es zutrifft. Wüsten sie es, könnten ihre Geschichten ganz anders verlaufen.

Um einen Tumor möglichst früh zu erkennen, kann die Software für eine Früherkennung von Tumoren benutzt werden. Dazu wird eine frühere Gehirnaufnahme des Patienten (Abb.2a) mit einer aktuellen Gehirnaufnahme (Abb.2b) mathematisch verglichen. Dabei wir mit dem entwickelten Algorithmus berechnet, auf welchen Stellen sich das Gehirn verändert hat. Veränderungen, die über einem Normalwert liegen, können automatisch gekennzeichnet (Abb.2c). Auf diese Art und Weise können sogar kaum mit bloßem Auge erkennbaren Veränderungen erfasst, langfristig verfolgt oder falls notwendig einer Therapie zugeführt werden.

Es wird erwartet, dass nach dem Abschluss der Testphase pathologische Hirnveränderungen lange vor dem Erscheinen der ersten krankhaften Symptome erkannt werden können. Dadurch kann die Heilungsprognose deutlich positiver ausfallen, da mit einer Therapie viel früher begonnen werden kann. Es wird gehofft, dass die obenerwähnte Gruppe von Menschen in der Zukunft nicht mehr wachsen wird und dass mit dem Verfahren möglichst vielen Menschen rechtzeitig geholfen werden kann.

Literatur
J.K. Mai, G. Paxinos, T. Voß, Atlas of the Human Brain, Elsevier, Amsterdam, 3rd ed., (2008).

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