DIE FÖRDERPROJEKTE DER JÖRG BERNARDS-STIFTUNG

Question 1

Lokale Ultraschall-vermittelte Cytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.11.2014 bis 31.10.2015

Answer

1. Zielsetzung
Ziel des vorliegenden Projektes ist es die Wirksamkeit und Selektivität der Chemotherapie von Tumorerkrankungen, insbesondere von Hirntumoren, zu verbessern indem Zytostatika in Microbubbles eingekapselt werden die lokal durch fokussierten Ultraschall zum Platzen gebracht werden so daß der Wirkstoff nur im Tumorgewebe freigesetzt wird während eine systemische Aktivität unterbunden ist. 2. Methoden Die Microbubbles sollen nach etablierten Methoden hergestellt und zunächst als sogenannte Dummys (ohne Zytostatika-Beladung) umfassend auf Stabilität, Größen-verteilung und Löslichkeit untersucht werden. Gängige Methoden dafür umfassen unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS) sowie die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie. Wichtige Parameter, die dabei ermittelt werden sollen sind der Einfluß von pH-Wert, Umgebungstemperatur und Licht sowie wiederholter Einfrier-/Auftau-Zyklen und Scherkräfte durch Schütteln bzw. Zentrifugieren auf die Integrität der Bubbles. Weiterhin sollten neue Wirkstoffkandidaten auf der Basis bekannter bioaktiver Platin-Verbindungen hergestellt werden die besonders einfach mit stark hydrophoben Gruppen für die Verankerung in der inneren Microbubble-Membran geeignet sind.
Auf der Basis dieser Daten soll dann in weiteren Projektschritten, für die aktuell eine DFG-Sachbeihilfe beantragt ist, zunächst das toxikologische Profil der Microbubbles mit und ohne Beladung sowie der nach Ultraschall-vermittelter Ruptur verbleibenden Bubble-Bausteine untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei vor allem der Immunokompatibilität dieser mikroskaligen Systeme gelten. Darauf aufbauend sind dann erste in vivo-Studien geplant. Neben einer Demonstration der Wirkstoff-Freisetzung durchUItraschall im lebenden Modellorganismus ist es hier insbesondere auch das Ziel,Bildgebungsmethoden zur in vivo-Visualisierung und zum Tracking der Microbubbles undihrer Bestandteile zu etablieren. 4. Ergebnisse
4.1 Herstellung und Charakterisierung der Microbubbles In der ersten Projektphase seit dem 01.03.2014 wurde im Labor von Prof. Schatzschneider zunächst die Herstellung mit Octafluorpropan gefüllter Microbubbles etabliert wobei das verwendete Verfahren hier nocheinmal in Abb. 1 gezeigt ist, für die weiteren experimentellen Details wird auf den vorherigen Bericht verwiesen.

Abb. 1: Verwendete Methode zur Herstellung der Microbubbles (nach: X. Shuai et al. Int. J. Nanomedicine 2012, 7, 895–904). Die Microbubbles können mittlerweile sehr zuverlässig hergestellt werden, wobei der
Prozess im Bezug auf Größenverteilung und Langzeitstabilität optimiert wurde. Als kritisch stellte sich dabei interessanterweise insbesondere die initiale Filmherstellung heraus. Durch Anfärbung der Bubbles mit 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiIC18) konnten sehr gute Ergebnisse bei der Analyse mittels Fluoreszenzmikroskpie erzielt werden, die im Tumorbiologie-Labor der Neurochirurgischen Klinik und Poliklinik des Universitätsklinikums Würzburg (PD Dr. Carsten Hagemann) durchgeführt werden und gegenüber einfachen lichtmikroskopischen Untersuchungen ein deutlich verbessertes Bild ergeben. In Abb. 2 ist eine solche repräsentative Aufnahme gezeigt aus der vor allem die enge Größenverteilung hervorgeht.

Abb. 2: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme mit DiIC18 angefärbter Microbubbles. 4.2 Zytotoxizitätsuntersuchungen an Glioblastom-Zellen Im Labor von Dr. Hagemann sind mittlerweile die Assays etabliert um die Zytotoxizität der verschiedenen Bubble-Komponenten sowie des Wirkstoffs mit und ohne Einschluß in die Microbubbles zu untersuchen. Dafür kommt der metabolische MTT-Assay zum Einsatz, der auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumfarbstoffs beruht, welcher von lebenden Zellen mit aktiven Mitochondrien zu einem blau-violetten Formazan reduziert wird. Die Stärke der Färbung korreliert dabei mit der Zahl der lebenden Zellen und nimmt mit der zytotoxischen Wirkung einer applizierten Substanz konzentrationsabhängig ab.
Tests mit zwei Platinverbindungen, dem etablierten Antitumor-Wirkstoffs Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2) und dem bekanntermaßen inaktiven Kaliumtetrachloroplatinat (K2[PtCl4]) ergaben die erwarteten Ergebnisse und zeigen die Funktionsfähigkeit des Assays an. In einem zweiten Schritt wurden dann die Lipidbausteine der Microbubbles getestet um, obwohl erwartet, deren Unbedenklichkeit auch experimentell zu verifizieren. Im Labor von Prof. Schatzschneider arbeitet Frau Mawamba zur Zeit an der Herstellung neuer Platin-basierter Wirkstoffkandidaten mit langen, hydrophoben Alkylketten die eine Integration in die Bubble-Membran ermöglichen sollen. Erste Verbindungen stehen mittlerweile für die biologischen Tests bereit.
Bis zum Jahresende soll nun ein Verfahren zur Beladung der Microbubbles mit dem organischen Wirkstoff Temozolomid etabliert werden, was insbesondere die Entwicklung einer Method zur HPLC(high-pressure liquid chromatography)-Bestimmung dieser Substanz in der Bubble-Phase und der überstehenden Lösung erfordert, während die Anlagerung Metall-basierten Wirkstoffkandidaten direkt über Messung des Platingehalts mittels ICP-MS oder AAS verfolgt werden soll. 4.3 DFG-Antrag Basierenden auf den mit Hilfe der Förderung durch die Jörg-Bernards-Stiftung durchgeführten Vorarbeiten konnte am 30.04.2015 der Antrag auf Sachbeihilfe für das Projekt "Lokale Freisetzung zytotoxischer Wirkstoffe zur Behandlung maligner Gliome unter Verwendung von fokussiertem Ultraschall" bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) eingereicht werden. Projektverantwortliche sind PD Dr. Carsten Hagemann (Neurochirurigsche Klinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Würzburg) und Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider (Institut für Anorganische Chemie, Universität Würzburg) mit PD Dr. Mario Löhr und Prof. Dr. Volker Sturm als weiteren Mitantragstellern. In insgesamt vier Arbeitspaketen (work packages, WPs) sollen über 36 Monate Laufzeit die Bubble-Herstellung und Beladung mit Wirkstoffen (WP1), die Bubble-Stabilität und Ultraschall-vermittelte Wirkstofffreisetzung (WP2) sowie die biologische Wirkung mit und ohne Ultraschall auf Glioblastom-Zellen in in vitro 2D- und 3D-Zellkulturen (WP3+4) untersucht werden. Die Gutachten liegen der DFG mittlerweile vor und mit einer Entscheidung des zuständigen Fachkollegiums wird im 1. Quartal 2016 gerechnet. 4.4 Ausblick Mit der erfolgreichen und reproduzierbaren Herstellung der Microbubbles sowie der Etablierung der in vitro-Zytotoxizitätsassays stehen nun prinzipiell alle Materialien und Methoden zur Verfügung um die differentielle Wirkung der beladenen Microbubbles mit und ohne Ultraschallwirkung zu untersuchen.
Wesentliches Hindernis für den weiteren Projektfortschritt ist aktuell jedoch des Fehlen eines Ultraschall-Transducers mit Kosten in Höhe von ca. € 33.500,- (Angebot des Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik IBMT in St. Ingbert, Preis inkl. MwSt.). Die Mittel für dieses essentielle Gerät sind zwar in dem DFG-Antrag enthalten (vide supra), werden aber selbst bei positiver Begutachtung vermutlich frühestens Mitte 2016 zur Verfügung stehen. Zwar soll in der Zwischenzeit versucht werden die Microbubbles durch andere Mechanismen zum Platzen zu bringen (Hitzeeinwirkung, starke Scherkräfte), dabei ist jedoch mit negativen Einflüsse auf den eingeschlossenen Wirkstoff, insbesondere bei erhöhten Temperaturen, zu rechnen und das Ziel des Projekts ist ja die zytotoxische Wirkung durch fokussierten Ultraschall zu lokalisieren.
Weiterhin wünschenswert wäre ein einfaches, gebrauchtes klinisches Ultraschallgerät, über das die Microbubbles über ihren differentiellen Kontrast relativ zum Medium direkt nachgewiesen werden könnte um ihre Stabilität in Modellsystemen für Blutgefäße untersuchen zu können. 5. Ausgaben
Für das Projekt standen auf Antrag vom 08.12.2014 im Berichtszeitraum zuzüglich der Deckung der restlichen Personalausgaben Mittel in Höhe von insgesamt € 7.500,- zur Verfügung, wobei von diesem Ansatz € 6.500,- für Sachkosten und € 1.000,- für Reisemittel vorgesehen waren. Als verantwortliche Mitarbeiterin ist seit 01.03.2014 Frau Vivane Mawamba (Bachelor Chemie Universität Jaunde I, Kamerun; Master Chemie TU Clausthal) nach TV-L 13 50% beschäftigt, die weiterhin herausragende Arbeit leistet. Besonders hervorzuheben ist dabei die ausgezeichnete Zusammenarbeit mit den Mitarbeiter/inne/n im Labor von Herrn PD Dr. Hagemann, in dem Frau Mawamba mittlerweile regelmäßig mikroskopische Untersuchungen zur Stabilität der Microbubbles durchführt. Frau Mawamba wird seit dem 01.03.2015 über eine Hausstelle aus den Berufungsmitteln von Herrn Prof. Schatzschneider finanziert, aus der ihre Stelle bis zur einer Promotionshöchstdauer von vier Jahren weiterfinanziert wird. Im Bereich der Sachmittel wurden im wesentlichen Basischemikalien beschafft (Sigma-Aldrich, Serva und Strem: € 2.595,94-). Zudem wurden einige Ersatzteile für defekte Laborgeräte benötigt (Evoqua und HekaTech: € 1.016,86-). Weitere sächliche Auslagen an die Firma MRC Systems GmbH in Heidelberg (€ 4.424,35-) werden von Prof. Sturm separat nachgewiesen. Reisekosten fielen in 2015 nicht an da die Teilnahme von Frau Mawamba und Prof. Schatzschneider am "European Molecular Imaging Meeting" (EMIM) in Tübingen (18. bis 20.03.2015) durch die COST Action TD1004 "Theranostics Imaging and Therapy" finanziert wurde, ebenso wie die Präsentation von Prof. Schatzschneider auf dem COST TD1004 Closing Meeting in Belgrad (10./11.09.2015). Diese Mittel wurden daher zur Deckung des erweiteren Sachmittelbedarfs herangezogen. Insgesamt wird dadurch für den Projektzeitraum 01.11.2014 bis 31.03.2016 ein Fehlbetrag in Höhe von € 4.119,67- erwartet, der im wesentlichen auf die unerwarteten Auslagen für die Fa. MRC Systems zurückzuführen ist. Für einen entsprechenden Ausgleich wären wir sehr dankbar.

Würzburg, 08.11.2013 Ulrich Schatzschneider

Question 2

Cytostatika-Applikation, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.03. bis 30.11.2014

Answer

1. Zielsetzung Ziel des vorliegenden Projektes ist es die Wirksamkeit und Selektivität der Chemotherapie von Tumorerkrankungen, insbesondere von Hirntumoren, zu verbessern indem Cytostatika in Microbubbles eingekapselt werden die lokal durch fokussierten Ultraschall zum Platzen gebracht werden so daß der Wirkstoff nur im Tumorgewebe freigesetzt wird während eine systemische Aktivität unterbunden ist. 2. Methoden Die Microbubbles sollten nach etablierten Methoden hergestellt und zunächst als sogenannte Dummys (ohne Cytostatika-Beladung) umfassend auf Stabilität, Größen-verteilung und Löslichkeit untersucht werden. Gängige Methoden dafür umfassen unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS) sowie die Lichtmikroskopie. Wichtige Parameter, die dabei ermittelt werden sollen sind der Einfluß von pH-Wert, Umgebungs-temperatur und Licht sowie wiederholter Einfrier-/Auftau-Zyklen und Scherkräfte durch Schütteln bzw. Zentrifugieren auf die Integrität der Bubbles. Weiterhin sollten neue Wirkstoffkandidaten auf der Basis bekannter bioaktiver Platin-Verbindungen hergestellt werden die besonders einfach mit stark hydrophoben Gruppen für die Verankerung in der inneren Microbubble-Membran geeignet sind. Auf der Basis dieser Daten soll dann in weiteren Projektschritten, für die aktuell eine DFG-Förderung beantragt wird, zunächst das toxikologische Profil der Microbubbles mit und ohne Beladung sowie der nach Ultraschall-vermittelter Ruptur verbleibenden Bubble-Bausteine untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei vor allem der Immunokompatibilität dieser mikroskaligen Systeme gelten. Darauf aufbauend sind dann erste in vivo-Studien geplant. Neben einer Demonstration der Wirkstoff-Freisetzung durch UItraschall im lebenden Modellorganismus ist es hier insbesondere auch das Ziel, Bildgebungsmethoden zur in vivo-Visualisierung und zum Tracking der Microbubbles und ihrer Bestandteile zu etablieren. 4. Ergebnisse Das Projekt startete am 01.03.2014 mit der Einstellung von Frau Viviane Mawamba als Doktorandin nach TVL13 50%. Sie verfügt über einen Hintergrund aus dem Bereich der bioabbaubaren Polymere und hat sich seitdem hervorragend in die Arbeitsgruppe eingefügt. Nach einer eingehenden Literaturrecherche wurde entschieden für die Synthese der Microbubbles die thin-film hydration-sonication-Method zu verwenden (Abb. 1).1 Dabei wird eine Phospholipid-Mischung (DPPC, DPPA und PEG2000-DSPE) in Chlorofom gelöst und nach Abdampfen des organischen Lösemittels ein Lipidfilm gebildet. Dieser wird dann bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (beschafft aus Projektmitteln) hydratisiert, wobei sich Liposomen bilden. Eine Suspension dieses Materials wird dann in einem Zentrifugen-röhrchen unter einer Atmosphäre von Octafluorpropan als Füllgas mit einem Ultraschall- Homogenisator (ebenfalls beschafft aus Projektmitteln) beschallt, wobei sich die Microbubbles bilden. Durch differentielle Zentrifugation können die verschiedenen Bubble- Fraktionen dann getrennt werden.2 Die Charakterisierung erfolgt im eigenen Labor mittels Lichtmikroskopie mit einer USB-Kamera zur Dokumentation sowie durch Dynamische Lichtstreuung (DLS) in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Anke Krüger ( Institut für Organische Chemie, Universität Würzburg).

Abb. 1: Verwendete Methode zur Synthese der Microbubbles (nach: X. Shuai et al. Int. J. Nanomedicine 2012, 7, 895–904). Der Beginn der Microbubble-Herstellung wurde dabei durch die unerwartet lange Lieferzeit für die Lipide (bezogen über Distributor Otto Nordwald von Avanti Polar Lipid, Alabaster, Alabama, USA) und das Octafluorpropan (Linde Spezialgase) erheblich verzögert. Durch regelmäßiges Verwiegen insbesondere der Gasflasche wird jedoch der Verbrauch an Ausgangsmaterialien nunmehr kontinuierlich fortgeschrieben so daß in Zukunft frühzeitig Ersatz bestellt werden kann. Für die Herstellung der Microbubbles unter Octafluorpropan-Atmosphäre wurde von Frau Mawamba ein Aufbau konstruiert der den Verbrauch an Lipiden wie an Füllgas minimiert. Bereits im ersten Versuch konnten Microbubbles erhalten werden die mit Lichtmikroskopie charakterisiert wurden. Mit dem vorhandenen Gerät (VisiScope BL224 PI mit 10 Megapixel USB-Kamera VisiCam) können dabei Bubbles bis zu einem Durchmesser von etwa 1 μm sicher identifiziert werden (Abb. 2a), für die noch kleineren Nanobubbles (d < 1 μm) reicht das Auflösungsvermögen unseres Mikroskops jedoch nichtmehr aus. Hier soll im neuen Jahr nach Markierung der Bubbles mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Dil, 1,1′-Dioctadecyl- 3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat) ein kürzlich im Labor von Dr. Carsten Hagemann (Neurochirurgische Klinik und Poliklinik, Universitäts-klinikum Würzburg) installierstes konfokales Fluoreszenzmikroskop mit wesentlich höherer Auflösung zur Charakterisierung herangezogen werden. Als kritischer Parameter für die Isolierung der Microbubbles mit einer möglichst reproduzierbaren und engen Größenverteilung stellte sich dabei der Zentrifugationsschritt heraus. Weiterhin ergaben Messungen daß es bei der Ultraschall-Applikation im Homogenisator abhängig von Dauer und Amplitude zu einem erheblichen Energieeintrag in die Suspension kommt. So steigt bei einer Ultraschall-Applikation für nur 5 min bei einer Amplitude von 50 % die Temperatur um fast 25 °C von Raumtemperatur auf über 50 °C an. Da die Bubbles abhängig von der Temperatur "reifen" ist eine sorgfältige Kontrolle auch dieses Parameters gefragt. Möglicherweise spielt dieser auch bei dem Zentrifugations-schritt eine Rolle, da die verwendeten Rotoren über keine Temperaturkontrolle verfügen, eine Messung ist jedoch schwierig.

Abb. 2: a) Lichtmikroskopische Aufnahme der ersten im Rahmen des Projekts hergestellten Microbubbles (40fache Vergrößerung) und b) Cisplatin-Derivat mit C16-Alkylketten als Membran-affines Wirkstoffderivat. Parallel zur Bubble-Herstellung und Charakterisierung hat Frau Mawamba auch damit begonnen, Derivate des etablierten Antitumor-Wirkstoffs Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2) herzustellen die über langkettige Alkylgruppen verfügen um so eine hohe Membran-Affinität sicherzustellen (Abb. 2b). Trotz anfänglicher erheblicher Verzögerung die durch die lange Lieferzeit der benötigten Materialien bedingt war ist das Projekt jedoch insgesamt sehr gut gestartet. Die ein-gestellte Mitarbeiterin hat alle Erwartungen sogar noch übertroffen, sich hervorragend in das Projekt eingearbeitet und auch sehr gut in die Arbeitsgruppe eingefügt. Es wurde eine Aufbau für die Herstellung der Microbubbles konstruiert und kritische Parameter für eine reproduzierbare und enge Größenverteilung ermittelt. Die ersten hergestellten Bubbles zeigen den gewünschten Durchmesser im unteren Mikrometer-Bereich und werden nun für eine weitergehende Charakterisierung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie mit einem Farbstoff markiert. Außerdem wurden erste Schritte hin zu Membran-affinen metallbasierten Wirkstoffkandidaten unternommen. Somit konnten alle wesentlichen Projektziele erreicht werden. In der nun folgenden Projektphase steht insbesondere die Etablierung der Zellkultur-Assays im Vordergrund sowie die Integration eines Systems für die Ultraschall-vermittelte Ruptur der Microbubbles um deren differentielle Wirkung auf Tumorzellkulturen mit und ohne Ultraschall-Einwirkung untersuchen zu können. 5. Ausgaben Für das Projekt standen auf Antrag vom 08.11.2013 Mittel in Höhe von insgesamt € 37.500,- zur Verfügung, wobei von diesem Ansatz € 30.000,- für Personalkosten und € 7.500,- für Sachmittel vorgesehen waren. Als Mitarbeiterin in dem Projekt wurde zum 01.03.2014 Frau Vivane Mawamba (Bachelor Chemie Universität Jaunde I, Kamerun; Master Chemie TU Clausthal) eingestellt die mit einem Hintergrund aus dem Bereich bioabbaubare Polymere über den passenden Hintergrund für das Vorhaben verfügt und sich seitdem hervorragend in die Arbeitsgruppe eingefügt hat. Die Personalkosten für die Monate März bis Oktober 2014 beliefen sich auf € 16.701,20- was bei einer Laufzeit von acht Monaten einem Betrag von € 2.087,65- pro Monat entspricht. Für die gesamte Projektdauer werden daher Personalausgaben in Höhe von € 25.051,80- zzgl. der Jahressonderleistung in Form von Weihnachtsgeld erwartet und der Personalansatz somit vermutlich geringfügig unterschritten. Frau Mawamba wird ab 01.03.2015 über eine Hausstelle aus den Berufungsmitteln von Herrn Prof. Schatzschneider bis zur einer Promotionshöchstdauer von 4 Jahren weiterfinanziert werden. Im Bereich der Sachmittel waren für die Herstellung der Microbubbles insbesondere die Beschaffung eines Schüttelinkubators (VWR: € 1.431,57-) und eines Ultraschall-Generators (Zinsser Analytics: € 3.263,81-) erforderlich. Weitere wesentliche Positionen stellten die Lipide für das Microbubble-Hüllmaterial (Avanti Polar Lipids durch Distributor Otto Nordwald: € 733,04-) und als Microbubble-Füllmaterial Octafluorpropan (Linde Spezialgase: € 956,28-) dar. Der Restbetrag verteilte sich dann auf weiteres Laborkleingerät sowie Basischemikalien (VWR, Sigma und Hartenstein: € 1.065,00-). Weitere sächliche Auslagen an die Firma MRC Systems GmbH in Heidelberg (€ 6.417,88-) werden von Prof. Sturm separat nachgewiesen. Reisekosten fielen in 2014 nicht an da die Teilnahme von Frau Mawamba an dem COST Action TD1004 "Theranostics Imaging and Therapy" Annual Meeting in Istanbul (03. und 04.10.2014), an dem sie sich einen Vortrag zum Thema "Microbubbles as drug carriers" beteiligt hat, und der 3. NanoFar Autumn School an der Université catholique de Louvain in Brüssel (20.–24.10.2014) dankenswerterweise von COST TD1004 erstattet wurden. Diese Mittel wurden daher zur Deckung des erweiteren Sachmittelbedarfs herangezogen. Insgesamt wird so für die Projektlaufzeit 01.03.2014 bis 28.02.2015 ein Fehlbetrag in Höhe von € 1.419,38- zzgl. des Betrags für die Weihnachtssonderzahlung, voraussichtlich insgesamt € 2.500,- erwartet, der im wesentlichen auf die unerwarteten Auslagen für die Fa. MRC Systems zurückzuführen ist. Für einen entsprechenden Ausgleich wären wir sehr dankbar.

Würzburg, 08.11.2013 Ulrich Schatzschneider

Question 3

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Answer

Im Tumorbiologie-Labor des Universitätsklinikums Würzburg in Kooperation mit dem Institut für Anorganische Chemie der Universität Würzburg Einen Einblick in typische Arbeitsschritte im Tumorbiologie-Labor der Universität Würzburg geben die beiden Fotos oben. Links analysiert der Biochemie-Student Wilfrid Dzokou auf dem Laptop Wachstumskurven von Krebszellen für seine Bachelorarbeit während rechts die Technische Laborassistentin Elisabeth Karl das xCELLigence-Gerät mit neuen Zellkulturplatten belädt. Anschließend wird die Tür des Brutschranks geschlossen um die Zellen unter konstanten Bedingungen, insbesondere bei 37 °C wie im menschlichen Körper, wachsen zu lassen.

Unten das Projektteam (von links nach rechts): Viviane Mawamba, Doktorandin am Institut für Anorganische Chemie, Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider, Leiter chemische Synthese und Microbubble-Herstellung, Priv.-Doz. Dr. Carsten Hagemann, Leiter des Tumorbiologie-Labors, Priv.-Doz. Dr. Mario Löhr und Prof. Dr. Volker Sturm, Leitung des ärztlichen Teams.

Elektronisch angesteuerte Transducer-Elemente erlauben die Fokussierung des Ultraschalls auf den Tumor

Durch sogenannte "phased array transducer", wie sie auch in der modernen Radartechnik zum Einsatz kommen, kann der Ultraschall alleine durch elektronische Ansteuerung der Transducer-Elemente in bestimmte Richtungen gelenkt werden. Für therapeutische Anwendungen ist daher geplant die Transducer in einem Helm zu fixieren so daß ihre Anordnung relativ zum Tumor auch bei Kopfbewegungen des Patienten konstant bleibt. Anhand von Tomographie-Bildern wird dann festgelegt welche Gehirn-Bereiche wie lange und wie intensiv dem fokussierten Ultraschall ausgesetzt werden sollen um die im Blutstrom zirkulierenden Microbubbles zum Platzen zu bringen und den enthaltenen Wirkstoff lokal freizusetzen. Dabei werden auch Unregelmäßigkeiten in der Struktur des Schädelknochens berücksichtigt.Anders als beispielsweise radioaktive Strahlung ist Ultraschall gesundheitlich unbedenklich und hat keinen schädlichen Einfluss auf das ebenfalls durchstrahlte gesunde Gewebe. Der verwendete Ultraschall ist dabei sehr ähnlich dem schon seit langem z.B. bei Schwangerschaftsuntersuchungen verwendeten.Die Abbildung zeigt die Aufnahme eines Gehirntumors (weiß umrandete Fläche in der oberen linken Kopfhälfte) mit der schematischen Darstellung zweier Transducer-Elemente und unterschiedlich abgestrahltem Ultraschall. Ultraschall-Behandlung bringt die Microbubbles zum Platzen und verwandelt die milchige Suspension in eine klare Lösung

Ultraschall bringt die Microbubbles zum Platzen Die Abbildung zeigt eine Suspension der Microbubbles in wässriger Lösung (links) vor und (rechts) nach Beschallung mit Ultraschall. Die Bubbles sind zu klein um sie ohne Mikroskop mit dem bloßen Auge erkennen zu können, ihre Lösungen erscheinen jedoch milchig, ganz wie bei Kuhmilch, die ebenfalls aus Fetttröpfchen in Wasser besteht. Durch die Einwirkung des Ultraschalls zerplatzen die Bubbles und zerfallen in ihre Bestandteile, die zu klein sind um noch Licht zu streuen. Daher ist die Ultraschall-behandelte Lösung klar. Mit einem Farbstoff markierte Microbubbles leuchten im Mikroskop und lassen die Bläschen erkennen die 50x kleiner sind als der Durchmesser eines menschlichen Haars.

Die Abbildung zeigt Microbubbles in deren Hülle ein Fluoreszenz-Farbstoff eingebettet ist. Dieser beginnt beim Anstrahlen im Mikroskop zu leuchten und macht so die Bläschen sichtbar. Mit einem Durchmesser von nur etwa einem Mikrometer (1 µm) sind die Microbubbles etwa 50x dünner als der Querschnitt eines menschlichen Haars und damit so klein daß sie auch durch die Kapillargefäße des menschlichen Blutkreislaufs wandern können ohne diese zu verstopfen. Die Hülle der Microbubbles besteht aus Lipid-Bausteinen ähnlich der Wand menschlicher Zellen und ist daher ebenso wie das Füllgas gesundheitlich unbedenklich. Nach dem Zerplatzen der Bubbles wird das ohnehin nur in geringsten Mengen aufgenommene Füllgas vermutlich über die Lungen wieder abgeatmet. In die lipophile, fettartige Hülle der Microbubbles können medizinische Wirkstoffe eingelagert werden, die so vor unspezifischen negativen Wechselwirkungen mit dem Körper geschützt sind, was die bekannten Nebenwirkungen einer Chemotherapie lindern soll. Erst im Tumor soll das Medikament dann durch Ultraschall-vermitteltes lokalisiertes Zerplatzen der Bubbles freigesetzt werden und seine Wirkung entfalten. Microbubbles und ihre Bausteine sind biologisch unbedenklich, Platin-basierte Wirkstoffe töten dagegen Krebszellen ab

Die biologische Wirkung einer chemischen Verbindung kann durch den MTT-Assay gemessen werden. Dieser beruht darauf daß lebende Zellen einen gelben Farbstoff zu einer violetten Verbindung reduzieren. Je weniger stark violett eine Zellkultur ist desto weniger lebende Zellen enthält diese, was in der Regel auf einer Skala von 0 bis 1 (entsprechend 0–100%) relativ zu unbehandelten Zellen angeben ist. Die Abbildung zeigt a) die vernachlässigbare Wirkung der Lipid-Bausteine (DPPA, DPPC, DSPE-PEG) der Microbubbles relativ zu eine Kontrollprobe sowie b) die gewünschte Inaktivität der intakten Microbubbles bis zu einer Millionen Bläschen pro Milliliter. Demgegenüber führt eine Behandlung mit c) Cisplatin, ein in der Chemotherapie insbesondere von Hodenkrebs sehr erfolgreich eingesetzter Wirkstoff, zu einer signifikanten Reduktion der Zahl der lebenden Zellen. Da Cisplatin nicht lipophil genug ist um in die Hülle der Microbubbles eingebaut zu werden wurde d) eine weitere experimentelle Substanz VM-046-01 hergestellt die über einen seifenartigen "Schwanz" verfügt mit dem sie sich an die Bubbles anlagern soll und die ebenfalls wirksam gegen die Hirntumorzellen ist. Projektziele: Die Untersuchungen wurden bisher ausschließlich aus Zuwendungen der Jörg Bernards-Stiftung, sowie aus Eigenmitteln der Klinik für Neurochirurgie des Universitätsklinikums und des Instituts für Anorganische Chemie der Universität Würzburg finanziert. Die oben skizzierten Zwischenergebnisse sind positiv. Die für den bisherigen Projektverlauf avisierten Ziele sind erreicht. Wir sehen damit gute Chancen, in den nächsten 2 bis
3 Jahren eine zumindest im Tierversuch einsetzbare Methodik zur verbesserten, d.h. lokalen Chemotherapie bösartiger Hirntumoren, sowie im nächsten Schritt auch bestimmter anderer Krebserkrankungen wie Mamma- und Prostatakarzinomen zu entwickeln. Dier hierzu notwendigen chemischen und biologischen Experimente können mit überschaubaren Mitteln realisiert werden. Dies schließt die Entwicklung und Anwendung einfacher, allerdings nur in Laborversuchen verwendbarer Ultraschall-Systeme ein. Ein wesentliches Zwischenziel war die aus Stiftungsmitteln finanzierte Konstruktion des bislang verwendeten Ultraschall-Systems, das für die weiterführenden Versuche noch modifiziert werden muss. Ziel ist der erfolgreiche Abschluss der chemischen und biologischen Entwicklungen, d.h. die Demonstration der erhöhten Wirksamkeit und Verträglichkeit des neuen Verfahrens. Nach der Ablehnung des vom DKFZ Heidelberg koordinierten interdisziplinären Projektes zur Entwicklung eines klinisch einsetzbaren Ultraschall-Systems ist es sehr fraglich, ob dieses Ziel erreichbar ist. Wir werden diese Problematik mit den Projektteilnehmern (insbesondere DKFZ Heidelberg und Fraunhofer Institut St. Ingbert und Kaiserslautern) diskutieren. Sollte dieses Projekt nicht finanzierbar sein, müsste das von uns in Würzburg entwickelte Verfahren industriellen Partnern zur Verfügung gestellt werden, um die Einführung in die Klinik zu ermöglichen. Für eine weitere Förderung des Würzburger Projektes wären wir sehr dankbar. Eine Abschätzung des Finanzbedarfes werden wir in Kürze nachreichen.

Question 4

Lokale Ultraschall-vermittelte Cytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.11.2014 bis 31.10.2015

Answer

1. Zielsetzung
Ziel des vorliegenden Projektes ist es die Wirksamkeit und Selektivität der Chemotherapie von Tumorerkrankungen, insbesondere von Hirntumoren, zu verbessern indem Zytostatika in Microbubbles eingekapselt werden die lokal durch fokussierten Ultraschall zum Platzen gebracht werden so daß der Wirkstoff nur im Tumorgewebe freigesetzt wird während eine systemische Aktivität unterbunden ist. 2. Methoden Die Microbubbles sollen nach etablierten Methoden hergestellt und zunächst als sogenannte Dummys (ohne Zytostatika-Beladung) umfassend auf Stabilität, Größen-verteilung und Löslichkeit untersucht werden. Gängige Methoden dafür umfassen unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS) sowie die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie. Wichtige Parameter, die dabei ermittelt werden sollen sind der Einfluß von pH-Wert, Umgebungstemperatur und Licht sowie wiederholter Einfrier-/Auftau-Zyklen und Scherkräfte durch Schütteln bzw. Zentrifugieren auf die Integrität der Bubbles. Weiterhin sollten neue Wirkstoffkandidaten auf der Basis bekannter bioaktiver Platin-Verbindungen hergestellt werden die besonders einfach mit stark hydrophoben Gruppen für die Verankerung in der inneren Microbubble-Membran geeignet sind.
Auf der Basis dieser Daten soll dann in weiteren Projektschritten, für die aktuell eine DFG-Sachbeihilfe beantragt ist, zunächst das toxikologische Profil der Microbubbles mit und ohne Beladung sowie der nach Ultraschall-vermittelter Ruptur verbleibenden Bubble-Bausteine untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei vor allem der Immunokompatibilität dieser mikroskaligen Systeme gelten. Darauf aufbauend sind dann erste in vivo-Studien geplant. Neben einer Demonstration der Wirkstoff-Freisetzung durchUItraschall im lebenden Modellorganismus ist es hier insbesondere auch das Ziel,Bildgebungsmethoden zur in vivo-Visualisierung und zum Tracking der Microbubbles undihrer Bestandteile zu etablieren. 4. Ergebnisse
4.1 Herstellung und Charakterisierung der Microbubbles In der ersten Projektphase seit dem 01.03.2014 wurde im Labor von Prof. Schatzschneider zunächst die Herstellung mit Octafluorpropan gefüllter Microbubbles etabliert wobei das verwendete Verfahren hier nocheinmal in Abb. 1 gezeigt ist, für die weiteren experimentellen Details wird auf den vorherigen Bericht verwiesen.

Abb. 1: Verwendete Methode zur Herstellung der Microbubbles (nach: X. Shuai et al. Int. J. Nanomedicine 2012, 7, 895–904). Die Microbubbles können mittlerweile sehr zuverlässig hergestellt werden, wobei der
Prozess im Bezug auf Größenverteilung und Langzeitstabilität optimiert wurde. Als kritisch stellte sich dabei interessanterweise insbesondere die initiale Filmherstellung heraus. Durch Anfärbung der Bubbles mit 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiIC18) konnten sehr gute Ergebnisse bei der Analyse mittels Fluoreszenzmikroskpie erzielt werden, die im Tumorbiologie-Labor der Neurochirurgischen Klinik und Poliklinik des Universitätsklinikums Würzburg (PD Dr. Carsten Hagemann) durchgeführt werden und gegenüber einfachen lichtmikroskopischen Untersuchungen ein deutlich verbessertes Bild ergeben. In Abb. 2 ist eine solche repräsentative Aufnahme gezeigt aus der vor allem die enge Größenverteilung hervorgeht.

Abb. 2: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme mit DiIC18 angefärbter Microbubbles. 4.2 Zytotoxizitätsuntersuchungen an Glioblastom-Zellen Im Labor von Dr. Hagemann sind mittlerweile die Assays etabliert um die Zytotoxizität der verschiedenen Bubble-Komponenten sowie des Wirkstoffs mit und ohne Einschluß in die Microbubbles zu untersuchen. Dafür kommt der metabolische MTT-Assay zum Einsatz, der auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumfarbstoffs beruht, welcher von lebenden Zellen mit aktiven Mitochondrien zu einem blau-violetten Formazan reduziert wird. Die Stärke der Färbung korreliert dabei mit der Zahl der lebenden Zellen und nimmt mit der zytotoxischen Wirkung einer applizierten Substanz konzentrationsabhängig ab.
Tests mit zwei Platinverbindungen, dem etablierten Antitumor-Wirkstoffs Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2) und dem bekanntermaßen inaktiven Kaliumtetrachloroplatinat (K2[PtCl4]) ergaben die erwarteten Ergebnisse und zeigen die Funktionsfähigkeit des Assays an. In einem zweiten Schritt wurden dann die Lipidbausteine der Microbubbles getestet um, obwohl erwartet, deren Unbedenklichkeit auch experimentell zu verifizieren. Im Labor von Prof. Schatzschneider arbeitet Frau Mawamba zur Zeit an der Herstellung neuer Platin-basierter Wirkstoffkandidaten mit langen, hydrophoben Alkylketten die eine Integration in die Bubble-Membran ermöglichen sollen. Erste Verbindungen stehen mittlerweile für die biologischen Tests bereit.
Bis zum Jahresende soll nun ein Verfahren zur Beladung der Microbubbles mit dem organischen Wirkstoff Temozolomid etabliert werden, was insbesondere die Entwicklung einer Method zur HPLC(high-pressure liquid chromatography)-Bestimmung dieser Substanz in der Bubble-Phase und der überstehenden Lösung erfordert, während die Anlagerung Metall-basierten Wirkstoffkandidaten direkt über Messung des Platingehalts mittels ICP-MS oder AAS verfolgt werden soll. 4.3 DFG-Antrag Basierenden auf den mit Hilfe der Förderung durch die Jörg-Bernards-Stiftung durchgeführten Vorarbeiten konnte am 30.04.2015 der Antrag auf Sachbeihilfe für das Projekt "Lokale Freisetzung zytotoxischer Wirkstoffe zur Behandlung maligner Gliome unter Verwendung von fokussiertem Ultraschall" bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) eingereicht werden. Projektverantwortliche sind PD Dr. Carsten Hagemann (Neurochirurigsche Klinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Würzburg) und Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider (Institut für Anorganische Chemie, Universität Würzburg) mit PD Dr. Mario Löhr und Prof. Dr. Volker Sturm als weiteren Mitantragstellern. In insgesamt vier Arbeitspaketen (work packages, WPs) sollen über 36 Monate Laufzeit die Bubble-Herstellung und Beladung mit Wirkstoffen (WP1), die Bubble-Stabilität und Ultraschall-vermittelte Wirkstofffreisetzung (WP2) sowie die biologische Wirkung mit und ohne Ultraschall auf Glioblastom-Zellen in in vitro 2D- und 3D-Zellkulturen (WP3+4) untersucht werden. Die Gutachten liegen der DFG mittlerweile vor und mit einer Entscheidung des zuständigen Fachkollegiums wird im 1. Quartal 2016 gerechnet. 4.4 Ausblick Mit der erfolgreichen und reproduzierbaren Herstellung der Microbubbles sowie der Etablierung der in vitro-Zytotoxizitätsassays stehen nun prinzipiell alle Materialien und Methoden zur Verfügung um die differentielle Wirkung der beladenen Microbubbles mit und ohne Ultraschallwirkung zu untersuchen.
Wesentliches Hindernis für den weiteren Projektfortschritt ist aktuell jedoch des Fehlen eines Ultraschall-Transducers mit Kosten in Höhe von ca. € 33.500,- (Angebot des Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik IBMT in St. Ingbert, Preis inkl. MwSt.). Die Mittel für dieses essentielle Gerät sind zwar in dem DFG-Antrag enthalten (vide supra), werden aber selbst bei positiver Begutachtung vermutlich frühestens Mitte 2016 zur Verfügung stehen. Zwar soll in der Zwischenzeit versucht werden die Microbubbles durch andere Mechanismen zum Platzen zu bringen (Hitzeeinwirkung, starke Scherkräfte), dabei ist jedoch mit negativen Einflüsse auf den eingeschlossenen Wirkstoff, insbesondere bei erhöhten Temperaturen, zu rechnen und das Ziel des Projekts ist ja die zytotoxische Wirkung durch fokussierten Ultraschall zu lokalisieren.
Weiterhin wünschenswert wäre ein einfaches, gebrauchtes klinisches Ultraschallgerät, über das die Microbubbles über ihren differentiellen Kontrast relativ zum Medium direkt nachgewiesen werden könnte um ihre Stabilität in Modellsystemen für Blutgefäße untersuchen zu können. 5. Ausgaben
Für das Projekt standen auf Antrag vom 08.12.2014 im Berichtszeitraum zuzüglich der Deckung der restlichen Personalausgaben Mittel in Höhe von insgesamt € 7.500,- zur Verfügung, wobei von diesem Ansatz € 6.500,- für Sachkosten und € 1.000,- für Reisemittel vorgesehen waren. Als verantwortliche Mitarbeiterin ist seit 01.03.2014 Frau Vivane Mawamba (Bachelor Chemie Universität Jaunde I, Kamerun; Master Chemie TU Clausthal) nach TV-L 13 50% beschäftigt, die weiterhin herausragende Arbeit leistet. Besonders hervorzuheben ist dabei die ausgezeichnete Zusammenarbeit mit den Mitarbeiter/inne/n im Labor von Herrn PD Dr. Hagemann, in dem Frau Mawamba mittlerweile regelmäßig mikroskopische Untersuchungen zur Stabilität der Microbubbles durchführt. Frau Mawamba wird seit dem 01.03.2015 über eine Hausstelle aus den Berufungsmitteln von Herrn Prof. Schatzschneider finanziert, aus der ihre Stelle bis zur einer Promotionshöchstdauer von vier Jahren weiterfinanziert wird. Im Bereich der Sachmittel wurden im wesentlichen Basischemikalien beschafft (Sigma-Aldrich, Serva und Strem: € 2.595,94-). Zudem wurden einige Ersatzteile für defekte Laborgeräte benötigt (Evoqua und HekaTech: € 1.016,86-). Weitere sächliche Auslagen an die Firma MRC Systems GmbH in Heidelberg (€ 4.424,35-) werden von Prof. Sturm separat nachgewiesen. Reisekosten fielen in 2015 nicht an da die Teilnahme von Frau Mawamba und Prof. Schatzschneider am "European Molecular Imaging Meeting" (EMIM) in Tübingen (18. bis 20.03.2015) durch die COST Action TD1004 "Theranostics Imaging and Therapy" finanziert wurde, ebenso wie die Präsentation von Prof. Schatzschneider auf dem COST TD1004 Closing Meeting in Belgrad (10./11.09.2015). Diese Mittel wurden daher zur Deckung des erweiteren Sachmittelbedarfs herangezogen. Insgesamt wird dadurch für den Projektzeitraum 01.11.2014 bis 31.03.2016 ein Fehlbetrag in Höhe von € 4.119,67- erwartet, der im wesentlichen auf die unerwarteten Auslagen für die Fa. MRC Systems zurückzuführen ist. Für einen entsprechenden Ausgleich wären wir sehr dankbar.

Würzburg, 08.11.2013 Ulrich Schatzschneider

Question 5

Cytostatika-Applikation, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.03. bis 30.11.2014

Answer

1. Zielsetzung Ziel des vorliegenden Projektes ist es die Wirksamkeit und Selektivität der Chemotherapie von Tumorerkrankungen, insbesondere von Hirntumoren, zu verbessern indem Cytostatika in Microbubbles eingekapselt werden die lokal durch fokussierten Ultraschall zum Platzen gebracht werden so daß der Wirkstoff nur im Tumorgewebe freigesetzt wird während eine systemische Aktivität unterbunden ist. 2. Methoden Die Microbubbles sollten nach etablierten Methoden hergestellt und zunächst als sogenannte Dummys (ohne Cytostatika-Beladung) umfassend auf Stabilität, Größen-verteilung und Löslichkeit untersucht werden. Gängige Methoden dafür umfassen unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS) sowie die Lichtmikroskopie. Wichtige Parameter, die dabei ermittelt werden sollen sind der Einfluß von pH-Wert, Umgebungs-temperatur und Licht sowie wiederholter Einfrier-/Auftau-Zyklen und Scherkräfte durch Schütteln bzw. Zentrifugieren auf die Integrität der Bubbles. Weiterhin sollten neue Wirkstoffkandidaten auf der Basis bekannter bioaktiver Platin-Verbindungen hergestellt werden die besonders einfach mit stark hydrophoben Gruppen für die Verankerung in der inneren Microbubble-Membran geeignet sind. Auf der Basis dieser Daten soll dann in weiteren Projektschritten, für die aktuell eine DFG-Förderung beantragt wird, zunächst das toxikologische Profil der Microbubbles mit und ohne Beladung sowie der nach Ultraschall-vermittelter Ruptur verbleibenden Bubble-Bausteine untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei vor allem der Immunokompatibilität dieser mikroskaligen Systeme gelten. Darauf aufbauend sind dann erste in vivo-Studien geplant. Neben einer Demonstration der Wirkstoff-Freisetzung durch UItraschall im lebenden Modellorganismus ist es hier insbesondere auch das Ziel, Bildgebungsmethoden zur in vivo-Visualisierung und zum Tracking der Microbubbles und ihrer Bestandteile zu etablieren. 4. Ergebnisse Das Projekt startete am 01.03.2014 mit der Einstellung von Frau Viviane Mawamba als Doktorandin nach TVL13 50%. Sie verfügt über einen Hintergrund aus dem Bereich der bioabbaubaren Polymere und hat sich seitdem hervorragend in die Arbeitsgruppe eingefügt. Nach einer eingehenden Literaturrecherche wurde entschieden für die Synthese der Microbubbles die thin-film hydration-sonication-Method zu verwenden (Abb. 1).1 Dabei wird eine Phospholipid-Mischung (DPPC, DPPA und PEG2000-DSPE) in Chlorofom gelöst und nach Abdampfen des organischen Lösemittels ein Lipidfilm gebildet. Dieser wird dann bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (beschafft aus Projektmitteln) hydratisiert, wobei sich Liposomen bilden. Eine Suspension dieses Materials wird dann in einem Zentrifugen-röhrchen unter einer Atmosphäre von Octafluorpropan als Füllgas mit einem Ultraschall- Homogenisator (ebenfalls beschafft aus Projektmitteln) beschallt, wobei sich die Microbubbles bilden. Durch differentielle Zentrifugation können die verschiedenen Bubble- Fraktionen dann getrennt werden.2 Die Charakterisierung erfolgt im eigenen Labor mittels Lichtmikroskopie mit einer USB-Kamera zur Dokumentation sowie durch Dynamische Lichtstreuung (DLS) in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Anke Krüger ( Institut für Organische Chemie, Universität Würzburg).

Abb. 1: Verwendete Methode zur Synthese der Microbubbles (nach: X. Shuai et al. Int. J. Nanomedicine 2012, 7, 895–904). Der Beginn der Microbubble-Herstellung wurde dabei durch die unerwartet lange Lieferzeit für die Lipide (bezogen über Distributor Otto Nordwald von Avanti Polar Lipid, Alabaster, Alabama, USA) und das Octafluorpropan (Linde Spezialgase) erheblich verzögert. Durch regelmäßiges Verwiegen insbesondere der Gasflasche wird jedoch der Verbrauch an Ausgangsmaterialien nunmehr kontinuierlich fortgeschrieben so daß in Zukunft frühzeitig Ersatz bestellt werden kann. Für die Herstellung der Microbubbles unter Octafluorpropan-Atmosphäre wurde von Frau Mawamba ein Aufbau konstruiert der den Verbrauch an Lipiden wie an Füllgas minimiert. Bereits im ersten Versuch konnten Microbubbles erhalten werden die mit Lichtmikroskopie charakterisiert wurden. Mit dem vorhandenen Gerät (VisiScope BL224 PI mit 10 Megapixel USB-Kamera VisiCam) können dabei Bubbles bis zu einem Durchmesser von etwa 1 μm sicher identifiziert werden (Abb. 2a), für die noch kleineren Nanobubbles (d < 1 μm) reicht das Auflösungsvermögen unseres Mikroskops jedoch nichtmehr aus. Hier soll im neuen Jahr nach Markierung der Bubbles mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Dil, 1,1′-Dioctadecyl- 3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat) ein kürzlich im Labor von Dr. Carsten Hagemann (Neurochirurgische Klinik und Poliklinik, Universitäts-klinikum Würzburg) installierstes konfokales Fluoreszenzmikroskop mit wesentlich höherer Auflösung zur Charakterisierung herangezogen werden. Als kritischer Parameter für die Isolierung der Microbubbles mit einer möglichst reproduzierbaren und engen Größenverteilung stellte sich dabei der Zentrifugationsschritt heraus. Weiterhin ergaben Messungen daß es bei der Ultraschall-Applikation im Homogenisator abhängig von Dauer und Amplitude zu einem erheblichen Energieeintrag in die Suspension kommt. So steigt bei einer Ultraschall-Applikation für nur 5 min bei einer Amplitude von 50 % die Temperatur um fast 25 °C von Raumtemperatur auf über 50 °C an. Da die Bubbles abhängig von der Temperatur "reifen" ist eine sorgfältige Kontrolle auch dieses Parameters gefragt. Möglicherweise spielt dieser auch bei dem Zentrifugations-schritt eine Rolle, da die verwendeten Rotoren über keine Temperaturkontrolle verfügen, eine Messung ist jedoch schwierig.

Abb. 2: a) Lichtmikroskopische Aufnahme der ersten im Rahmen des Projekts hergestellten Microbubbles (40fache Vergrößerung) und b) Cisplatin-Derivat mit C16-Alkylketten als Membran-affines Wirkstoffderivat. Parallel zur Bubble-Herstellung und Charakterisierung hat Frau Mawamba auch damit begonnen, Derivate des etablierten Antitumor-Wirkstoffs Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2) herzustellen die über langkettige Alkylgruppen verfügen um so eine hohe Membran-Affinität sicherzustellen (Abb. 2b). Trotz anfänglicher erheblicher Verzögerung die durch die lange Lieferzeit der benötigten Materialien bedingt war ist das Projekt jedoch insgesamt sehr gut gestartet. Die ein-gestellte Mitarbeiterin hat alle Erwartungen sogar noch übertroffen, sich hervorragend in das Projekt eingearbeitet und auch sehr gut in die Arbeitsgruppe eingefügt. Es wurde eine Aufbau für die Herstellung der Microbubbles konstruiert und kritische Parameter für eine reproduzierbare und enge Größenverteilung ermittelt. Die ersten hergestellten Bubbles zeigen den gewünschten Durchmesser im unteren Mikrometer-Bereich und werden nun für eine weitergehende Charakterisierung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie mit einem Farbstoff markiert. Außerdem wurden erste Schritte hin zu Membran-affinen metallbasierten Wirkstoffkandidaten unternommen. Somit konnten alle wesentlichen Projektziele erreicht werden. In der nun folgenden Projektphase steht insbesondere die Etablierung der Zellkultur-Assays im Vordergrund sowie die Integration eines Systems für die Ultraschall-vermittelte Ruptur der Microbubbles um deren differentielle Wirkung auf Tumorzellkulturen mit und ohne Ultraschall-Einwirkung untersuchen zu können. 5. Ausgaben Für das Projekt standen auf Antrag vom 08.11.2013 Mittel in Höhe von insgesamt € 37.500,- zur Verfügung, wobei von diesem Ansatz € 30.000,- für Personalkosten und € 7.500,- für Sachmittel vorgesehen waren. Als Mitarbeiterin in dem Projekt wurde zum 01.03.2014 Frau Vivane Mawamba (Bachelor Chemie Universität Jaunde I, Kamerun; Master Chemie TU Clausthal) eingestellt die mit einem Hintergrund aus dem Bereich bioabbaubare Polymere über den passenden Hintergrund für das Vorhaben verfügt und sich seitdem hervorragend in die Arbeitsgruppe eingefügt hat. Die Personalkosten für die Monate März bis Oktober 2014 beliefen sich auf € 16.701,20- was bei einer Laufzeit von acht Monaten einem Betrag von € 2.087,65- pro Monat entspricht. Für die gesamte Projektdauer werden daher Personalausgaben in Höhe von € 25.051,80- zzgl. der Jahressonderleistung in Form von Weihnachtsgeld erwartet und der Personalansatz somit vermutlich geringfügig unterschritten. Frau Mawamba wird ab 01.03.2015 über eine Hausstelle aus den Berufungsmitteln von Herrn Prof. Schatzschneider bis zur einer Promotionshöchstdauer von 4 Jahren weiterfinanziert werden. Im Bereich der Sachmittel waren für die Herstellung der Microbubbles insbesondere die Beschaffung eines Schüttelinkubators (VWR: € 1.431,57-) und eines Ultraschall-Generators (Zinsser Analytics: € 3.263,81-) erforderlich. Weitere wesentliche Positionen stellten die Lipide für das Microbubble-Hüllmaterial (Avanti Polar Lipids durch Distributor Otto Nordwald: € 733,04-) und als Microbubble-Füllmaterial Octafluorpropan (Linde Spezialgase: € 956,28-) dar. Der Restbetrag verteilte sich dann auf weiteres Laborkleingerät sowie Basischemikalien (VWR, Sigma und Hartenstein: € 1.065,00-). Weitere sächliche Auslagen an die Firma MRC Systems GmbH in Heidelberg (€ 6.417,88-) werden von Prof. Sturm separat nachgewiesen. Reisekosten fielen in 2014 nicht an da die Teilnahme von Frau Mawamba an dem COST Action TD1004 "Theranostics Imaging and Therapy" Annual Meeting in Istanbul (03. und 04.10.2014), an dem sie sich einen Vortrag zum Thema "Microbubbles as drug carriers" beteiligt hat, und der 3. NanoFar Autumn School an der Université catholique de Louvain in Brüssel (20.–24.10.2014) dankenswerterweise von COST TD1004 erstattet wurden. Diese Mittel wurden daher zur Deckung des erweiteren Sachmittelbedarfs herangezogen. Insgesamt wird so für die Projektlaufzeit 01.03.2014 bis 28.02.2015 ein Fehlbetrag in Höhe von € 1.419,38- zzgl. des Betrags für die Weihnachtssonderzahlung, voraussichtlich insgesamt € 2.500,- erwartet, der im wesentlichen auf die unerwarteten Auslagen für die Fa. MRC Systems zurückzuführen ist. Für einen entsprechenden Ausgleich wären wir sehr dankbar.

Würzburg, 08.11.2013 Ulrich Schatzschneider

Question 6

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Im Tumorbiologie-Labor des Universitätsklinikums Würzburg in Kooperation mit dem Institut für Anorganische Chemie der Universität Würzburg Einen Einblick in typische Arbeitsschritte im Tumorbiologie-Labor der Universität Würzburg geben die beiden Fotos oben. Links analysiert der Biochemie-Student Wilfrid Dzokou auf dem Laptop Wachstumskurven von Krebszellen für seine Bachelorarbeit während rechts die Technische Laborassistentin Elisabeth Karl das xCELLigence-Gerät mit neuen Zellkulturplatten belädt. Anschließend wird die Tür des Brutschranks geschlossen um die Zellen unter konstanten Bedingungen, insbesondere bei 37 °C wie im menschlichen Körper, wachsen zu lassen.

Unten das Projektteam (von links nach rechts): Viviane Mawamba, Doktorandin am Institut für Anorganische Chemie, Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider, Leiter chemische Synthese und Microbubble-Herstellung, Priv.-Doz. Dr. Carsten Hagemann, Leiter des Tumorbiologie-Labors, Priv.-Doz. Dr. Mario Löhr und Prof. Dr. Volker Sturm, Leitung des ärztlichen Teams.

Elektronisch angesteuerte Transducer-Elemente erlauben die Fokussierung des Ultraschalls auf den Tumor

Durch sogenannte "phased array transducer", wie sie auch in der modernen Radartechnik zum Einsatz kommen, kann der Ultraschall alleine durch elektronische Ansteuerung der Transducer-Elemente in bestimmte Richtungen gelenkt werden. Für therapeutische Anwendungen ist daher geplant die Transducer in einem Helm zu fixieren so daß ihre Anordnung relativ zum Tumor auch bei Kopfbewegungen des Patienten konstant bleibt. Anhand von Tomographie-Bildern wird dann festgelegt welche Gehirn-Bereiche wie lange und wie intensiv dem fokussierten Ultraschall ausgesetzt werden sollen um die im Blutstrom zirkulierenden Microbubbles zum Platzen zu bringen und den enthaltenen Wirkstoff lokal freizusetzen. Dabei werden auch Unregelmäßigkeiten in der Struktur des Schädelknochens berücksichtigt.Anders als beispielsweise radioaktive Strahlung ist Ultraschall gesundheitlich unbedenklich und hat keinen schädlichen Einfluss auf das ebenfalls durchstrahlte gesunde Gewebe. Der verwendete Ultraschall ist dabei sehr ähnlich dem schon seit langem z.B. bei Schwangerschaftsuntersuchungen verwendeten.Die Abbildung zeigt die Aufnahme eines Gehirntumors (weiß umrandete Fläche in der oberen linken Kopfhälfte) mit der schematischen Darstellung zweier Transducer-Elemente und unterschiedlich abgestrahltem Ultraschall. Ultraschall-Behandlung bringt die Microbubbles zum Platzen und verwandelt die milchige Suspension in eine klare Lösung

Ultraschall bringt die Microbubbles zum Platzen Die Abbildung zeigt eine Suspension der Microbubbles in wässriger Lösung (links) vor und (rechts) nach Beschallung mit Ultraschall. Die Bubbles sind zu klein um sie ohne Mikroskop mit dem bloßen Auge erkennen zu können, ihre Lösungen erscheinen jedoch milchig, ganz wie bei Kuhmilch, die ebenfalls aus Fetttröpfchen in Wasser besteht. Durch die Einwirkung des Ultraschalls zerplatzen die Bubbles und zerfallen in ihre Bestandteile, die zu klein sind um noch Licht zu streuen. Daher ist die Ultraschall-behandelte Lösung klar. Mit einem Farbstoff markierte Microbubbles leuchten im Mikroskop und lassen die Bläschen erkennen die 50x kleiner sind als der Durchmesser eines menschlichen Haars.

Die Abbildung zeigt Microbubbles in deren Hülle ein Fluoreszenz-Farbstoff eingebettet ist. Dieser beginnt beim Anstrahlen im Mikroskop zu leuchten und macht so die Bläschen sichtbar. Mit einem Durchmesser von nur etwa einem Mikrometer (1 µm) sind die Microbubbles etwa 50x dünner als der Querschnitt eines menschlichen Haars und damit so klein daß sie auch durch die Kapillargefäße des menschlichen Blutkreislaufs wandern können ohne diese zu verstopfen. Die Hülle der Microbubbles besteht aus Lipid-Bausteinen ähnlich der Wand menschlicher Zellen und ist daher ebenso wie das Füllgas gesundheitlich unbedenklich. Nach dem Zerplatzen der Bubbles wird das ohnehin nur in geringsten Mengen aufgenommene Füllgas vermutlich über die Lungen wieder abgeatmet. In die lipophile, fettartige Hülle der Microbubbles können medizinische Wirkstoffe eingelagert werden, die so vor unspezifischen negativen Wechselwirkungen mit dem Körper geschützt sind, was die bekannten Nebenwirkungen einer Chemotherapie lindern soll. Erst im Tumor soll das Medikament dann durch Ultraschall-vermitteltes lokalisiertes Zerplatzen der Bubbles freigesetzt werden und seine Wirkung entfalten. Microbubbles und ihre Bausteine sind biologisch unbedenklich, Platin-basierte Wirkstoffe töten dagegen Krebszellen ab

Die biologische Wirkung einer chemischen Verbindung kann durch den MTT-Assay gemessen werden. Dieser beruht darauf daß lebende Zellen einen gelben Farbstoff zu einer violetten Verbindung reduzieren. Je weniger stark violett eine Zellkultur ist desto weniger lebende Zellen enthält diese, was in der Regel auf einer Skala von 0 bis 1 (entsprechend 0–100%) relativ zu unbehandelten Zellen angeben ist. Die Abbildung zeigt a) die vernachlässigbare Wirkung der Lipid-Bausteine (DPPA, DPPC, DSPE-PEG) der Microbubbles relativ zu eine Kontrollprobe sowie b) die gewünschte Inaktivität der intakten Microbubbles bis zu einer Millionen Bläschen pro Milliliter. Demgegenüber führt eine Behandlung mit c) Cisplatin, ein in der Chemotherapie insbesondere von Hodenkrebs sehr erfolgreich eingesetzter Wirkstoff, zu einer signifikanten Reduktion der Zahl der lebenden Zellen. Da Cisplatin nicht lipophil genug ist um in die Hülle der Microbubbles eingebaut zu werden wurde d) eine weitere experimentelle Substanz VM-046-01 hergestellt die über einen seifenartigen "Schwanz" verfügt mit dem sie sich an die Bubbles anlagern soll und die ebenfalls wirksam gegen die Hirntumorzellen ist. Projektziele: Die Untersuchungen wurden bisher ausschließlich aus Zuwendungen der Jörg Bernards-Stiftung, sowie aus Eigenmitteln der Klinik für Neurochirurgie des Universitätsklinikums und des Instituts für Anorganische Chemie der Universität Würzburg finanziert. Die oben skizzierten Zwischenergebnisse sind positiv. Die für den bisherigen Projektverlauf avisierten Ziele sind erreicht. Wir sehen damit gute Chancen, in den nächsten 2 bis
3 Jahren eine zumindest im Tierversuch einsetzbare Methodik zur verbesserten, d.h. lokalen Chemotherapie bösartiger Hirntumoren, sowie im nächsten Schritt auch bestimmter anderer Krebserkrankungen wie Mamma- und Prostatakarzinomen zu entwickeln. Dier hierzu notwendigen chemischen und biologischen Experimente können mit überschaubaren Mitteln realisiert werden. Dies schließt die Entwicklung und Anwendung einfacher, allerdings nur in Laborversuchen verwendbarer Ultraschall-Systeme ein. Ein wesentliches Zwischenziel war die aus Stiftungsmitteln finanzierte Konstruktion des bislang verwendeten Ultraschall-Systems, das für die weiterführenden Versuche noch modifiziert werden muss. Ziel ist der erfolgreiche Abschluss der chemischen und biologischen Entwicklungen, d.h. die Demonstration der erhöhten Wirksamkeit und Verträglichkeit des neuen Verfahrens. Nach der Ablehnung des vom DKFZ Heidelberg koordinierten interdisziplinären Projektes zur Entwicklung eines klinisch einsetzbaren Ultraschall-Systems ist es sehr fraglich, ob dieses Ziel erreichbar ist. Wir werden diese Problematik mit den Projektteilnehmern (insbesondere DKFZ Heidelberg und Fraunhofer Institut St. Ingbert und Kaiserslautern) diskutieren. Sollte dieses Projekt nicht finanzierbar sein, müsste das von uns in Würzburg entwickelte Verfahren industriellen Partnern zur Verfügung gestellt werden, um die Einführung in die Klinik zu ermöglichen. Für eine weitere Förderung des Würzburger Projektes wären wir sehr dankbar. Eine Abschätzung des Finanzbedarfes werden wir in Kürze nachreichen.

Question 7

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die Programmierung der Schnittstellen zwischen Benutzeroberfläche und Laborgerät
die Überarbeitung des Laborgeräts im Hinblick auf Mobilität und einfache Bedienung, inklusive Einbau einer geeigneten Frontplatte
die Anschaffung eines in Zell- und Tierversuchen einsetzbaren Ultraschall-Wandlers und dessen Erprobung mit dem Laborgerät

Dr. Marcus Götz – 31.10.2015

Answer

Im weiteren Projektverlauft soll das von dem Studenten aufgebaute Laborgerät von Mitarbeitern der MRC im Hinblick auf Benutzerfreundlichkeit so weiter entwickelt werden, dass es an der Universität Würzburg und/oder am Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg eingesetzt werden kann. Des Weiteren hat das Kuratorium der Jörg Bernards-Stiftung der Anschaffung eines Schallwandlers zugestimmt.
Projektziele In diesem Projekt soll die erforderliche Gerätetechnik für implantierten Ultraschall untersucht werden. Das Ziel wurde mittlerweile dahingehend konkretisiert, dass ein Laborgerät aufgebaut werden soll, mit dem erste in-vitro und in-vivo Einsätze ermöglicht werden sollen. Daraus sollen Erkenntnisse zur Einschätzung verschiedener Fragen für eine zukünftige Geräte- und Methodenentwicklung gewonnen werden. Bisherige Ergebnisse 1. Gerätetechnik Die wesentlichen Ergebnisse zur Gerätetechnik wurden bereits in den vorausgegangenen Berichten dargestellt. Die folgende Abbildung zeigt ein Bild des aktuellen Geräts:

Abbildung 2: Laborgerät zur Ansteuerung von Ultraschall-Wandlern Die angestrebte Funktion des Geräts ist bereits realisiert. Mit seinen aktuell umgesetzten zwei Kanälen können zwei Ultraschall-Wandler mit einer programmierbaren Frequenz,
Phasenverschiebung und Amplitude angesteuert werden.
2. Experimente mit Ultraschallwandler Zum Test des Laborgeräts wurden Experimente mit einem vom Fraunhofer-Institut für
Biomedizinische Technik IBMT ausgeliehenen Ultraschallarray-Testmuster mit sieben Elementen und einem Ultraschall-Empfänger durchgeführt. Dabei wurden im Wasserbad die relativen Amplituden in verschiedenen Abständen vom Ultraschall-Array ermittelt. Außerdem wurden die Fokusbreite und etwaige Interferenzeigenschaften verschiedener Felder des Arrays bestimmt. 3 . Graphische Benutzeroberfläche Zur einfacheren Bedienbarkeit des Geräts wurde eine graphische Benutzeroberfläche entworfen, die die Eingabe der Ultraschallparameter und das Starten und Stoppen der Applikation erlaubt. Die folgende Abbildung zeigt diesen Entwurf:

Abbildung 2: Graphische Benutzeroberfläche zur Ansteuerung des Laborgeräts Bisheriger Mitteleinsatz Bisher wurden nur die Mittel für den Einsatz des Studenten abgerufen. Die weiteren Personal und Sachmittel für die Überarbeitung des Labormusters und die Software-Entwicklung werden erst im letzten Quartal 2015 benötigt. Zusammenfassung und aktueller Ausblick Mit dem Laborgerät wurde eine Basis zur Untersuchung von Ultraschallparametern entwickelt. Die Elektronik ist zunächst auf zwei Kanäle ausgelegt, aber auf mehrere Kanäle erweiterbar, so dass bei Hinzufügen weiterer Verstärker auch ein Phasenarray angesteuert werden kann. Die oben gezeigt Benutzeroberfläche wird im vorläufig letzten Schritt in den nächsten Wochen über Schnittstellen mit dem Laborgerät verbunden werden. Diese Aufgabe, die den Studenten überfordert hätten, übernehmen erfahrene Physiker und Ingenieure. Weitere Schritte im Projekt sind also:

Question 8

Ultraschall-induzierte Tumorbehandlung 30.11.2014

Vorverstärkung: Die an den Ausgängen des Frequenzgenerators liegenden festen Amplituden werden in einen variablen Vorverstärker gespeist. Dessen Amplitude wird genauso wie der Frequenzgenerator selbst mit dem Mikrocontroller gesteuert. Damit werden zunächst Amplituden bis 1,2V erzeugt.
Zwischenverstärkung: Diese Stufe sorgt für höhere Amplituden von bis zu ca. 14 V, abhängig von der Frequenz.
Hochspannungsverstärkung: Schließlich wird ein Festverstärker eingesetzt, an dessen Ausgang die in Abbildung 2 aufgetragenen Werte, abhängig von der Frequenz, realisiert werden konnten.

Abbildung 2: Spannung in Abhängigkeit der Frequenz nach der dreistufigen Verstärkung 3 . Schaltungsdesign, Aufbau Laborgerät Die in den Abschnitten 1 und 2 dargestellten Komponenten wurden mittlerweile in einen gemeinsamen Schaltplan überführt, aus dem nach entsprechendem Routing ein Layout für eine Platine erstellt wurde. Die Platine wurde extern gefertigt und intern bestückt. Sie ist zunächst zur Ansteuerung von zwei Kanälen ausgeführt. Zum Abschluss der Bachelorarbeit sollen Frequenzgenerator, Verstärker und Spannungsversorgung in ein gemeinsames Rack integriert werden, so dass die Elektronik als portables Gerät eingesetzt werden kann. 4 . Beschaffung Ultraschall-Phasenarray Wie im letzten Bericht schon angedeutet, ist während der Projektlaufzeit der Kontakt zum Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik in St. Ingbert entstanden, dessen Schwerpunkt die Herstellung und Anwendung von verschiedenen Ultraschallsystemen darstellt. Wenige Tage vor Zusammenstellung des vorliegenden Berichts konnten wir von diesem Institut ein einfaches Ultraschall-Testmuster erhalten. Es handelt sich um ein 1-dimensionales Array, das bei einer Frequenz von 360 Hz arbeitet und somit von unserer Elektronik angesteuert werden kann. Das Array ist im Hinblick auf Arraygröße und Anordnung der Elemente nicht für die ursprünglich angedachten Versuche zur Bestimmung möglicher Fokusgrößen geeignet. Wir sind aber froh, immerhin einen Ultraschall-Transducer zu haben, mit dem wir nun die Elektronik experimentell überprüfen können. Die mit einem französischen Hersteller von klinisch einsetzbaren Ultraschall-Phasenarrays geführten Gespräche wurden zunächst nicht fortgesetzt, nachdem mit dem Fraunhofer-Institut eine Alternative zur Bereitstellung von experimentellen Arrays zur Verfügung Stand. Bisheriger Mitteleinsatz Die Mittel wurden weiterhin für eine studentische Personalstelle und für elektronische Kleinteile eingesetzt. In der Anlage findet sich eine Übersicht über die bisher aufgelaufenen Kosten. Zusammenfassung und aktueller Ausblick Mit der Elektronik wurde eine Basis geschaffen, die zukünftig in ein Laborgerät zur Untersuchung der Ultraschallparameter eingesetzt werden kann. Im Berichtszeitraum konnte der Frequenzgenerator um einen phasentreuen Verstärker ergänzt werden. Die Elektronik ist erweiterbar auf mehrere Kanäle, so dass auch ein Phasenarray angesteuert werden kann. Weitere Schritte im Projekt sind • die Erweiterung der Elektronik auf mehrere Kanäle • die praktische Erprobung anhand des kürzlich erhaltenen Ultraschall-Testmusters. Außerdem müsste vor dem Einsatz des Laborgeräts durch Biologen und Mediziner die Benutzerfreundlichkeit durch eine graphische Benutzeroberfläche geschaffen werden, die dem Anwender erlaubt, die Ultraschallparameter (Frequenz, Pulslänge, Pulsdauer, Amplitude, vielleicht weitere) einfacher als bislang zu steuern. Sie sollte skalierbar sein, damit zukünftig auch Arrays mit mehr Kanälen angesteuert werden können. Hierfür müssten eine Schnittstelle zwischen dem Computer und dem Microcontroller des Laborgeräts geschaffen und die entsprechende Eingabemaske programmiert werden. Dr. Marcus Götz – 30.11.2014

Answer

Rahmenbedingungen Mit Mitteln der Jörg Bernards-Stiftung wurde zunächst die Praktikumsarbeit und danach die Bachelorarbeit eines Studenten der Medizintechnik unterstützt. Die Arbeiten wurden bei der MRC Systems GmbH durchgeführt und von der Hochschule Mannheim betreut. Die Stelle wurde mit Herrn Romeo Hollan besetzt. Wir stehen in ständigem Kontakt mit Professor Sturm. Die Bachelorarbeit soll bis Ende des Jahres 2014 abgeschlossen werden. Projektziele In diesem Projekt soll die erforderliche Gerätetechnik für implantierten Ultraschall untersucht werden. Hierzu soll eine technische Machbarkeitsstudie durchgeführt werden, die die Einschätzung verschiedener Fragen für eine zukünftige Geräte- und Methodenentwicklung erleichtert. Bisherige Ergebnisse 1. Frequenzgenerator Wie im letzten Zwischenbericht dargestellt, war zunächst ein Mehrkanal-Frequenzgenerator aufgebaut worden mit Sinussignal, einstellbarer Frequenz, gepulsten Signalformen und der Möglichkeit, die relative Phasenlage der einzelnen Kanäle festzulegen. Die folgende Abbildung zeigt noch einmal exemplarisch eine der Tiefenhirnstimulation nachempfundene Pulsform. In Fortsetzung dieser Arbeit wurde die Software des Microcontrollers dahingehend erweitert, dass der Anwender Frequenzen, Phasenbeziehungen, Pulsdauern und Pulsabstände vorgeben kann. Diese Eingabe erfolgt über Texteingaben, ist also praktikabel, aber noch nicht benutzerfreundlich. 2. Verstärkung In einem nächsten Schritt wurde das Konzept einer mehrstufigen Verstärkung der Signale entworfen, das die Leistungen bereitstellt, die zur Ansteuerung von Ultraschall-Transducern erforderlich sind. Diese Verstärkung besteht aus:

Question 9

Ultraschall-induzierte Tumorbehandlung 05.05.2014

Für die Personalstelle haben wir bis Ende April 2014 (5 Monate Praktikum und 4 Monate Werksstudenten-Tätigkeit) ca. 5.400 EUR eingesetzt.
Für elektronische Kleinteile (inkl. Microcontrollern) wurden bislang 310 EUR eingesetzt. Darüber hinaus benötigte Komponenten wurden aus unserem Bestand entnommen.

Zusammenfassung und aktueller Ausblick Mit der Elektronik wurde eine Basis geschaffen, die zukünftig in ein Laborgerät zur Untersuchung der Ultraschallparameter eingesetzt werden kann. Sie ist erweiterbar auf mehrere Kanäle, so dass auch ein Phasenarray angesteuert werden kann. Durch die aktuelle Weiterbeschäftigung als Werksstudent wird die Programmierung des Microcontrollers dahingehend erweitert, dass der Anwender über eine Benutzerschnittstelle Frequenzen, Phasenbeziehungen und Pulsmuster von außen vorgeben kann. Diese werden über das Microcontroller-Board appliziert. In einem weiteren Schritt steht die Integration der Ansteuerungselektronik mit dem noch zu beschaffenden Ultraschall-Phasenarray an. Ergänzend wird dann noch ein phasentreuer Verstärker benötigt. Solche Verstärker setzen wir in einem bestehenden Produkt bereits ein, so dass wir erwarten, dass für den Einsatz im vorliegenden Projekt nur geringfügige Anpassungen vorgenommen werden müssen. Den zeitlich kritischsten Teil stellt also derzeit die Beschaffung des Phasenarrays dar. Für dessen Ansteuerung sind dann weitere Arbeiten wie das Multiplexing und die Verstärkung der Signale erforderlich. Diese Arbeiten hängen aber auch von der Anzahl der Kanäle des Phasenarrays ab, die derzeit noch nicht feststeht. Herr Hollan hat sein Interesse bekundet, bei uns auch seine Bachelor-Arbeit durchzuführen. Zugunsten der Fortsetzung seiner Arbeiten halten wir dies für eine sinnvolle Option. Dabei bleibt unser Ziel, das vorgegebene Budget einzuhalten. Dr. Marcus Götz – 05.05.2014

Answer

Rahmenbedingungen Mit Mitteln der Jörg Bernards-Stiftung wurde die Praktikumsarbeit eines Studenten der Medizintechnik unterstützt. Die Praktikumsarbeit wurde bei der MRC Systems GmbH durchgeführt und von der Hochschule Mannheim betreut. Die Stelle wurde mit Herrn Romeo Hollan besetzt. Wir stehen in ständigem Kontakt mit Professor Sturm. Das Praktikum fand im Zeitraum 1.8.2013 bis 30.12.2013 statt und wurde mit einem ausführlichen Bericht abgeschlossen. Seither arbeitet Herr Hollan als Werksstudent auf Honorarbasis weiter an dem Projekt. Der Abschluss des Praktikums wurde aber zum Anlass für diesen Zwischenbericht genommen. Projektziele In diesem Projekt soll die erforderliche Gerätetechnik für implantierten Ultraschall untersucht werden. Hierzu soll eine technische Machbarkeitsstudie durchgeführt werden, die die Einschätzung verschiedener Fragen für eine zukünftige Geräte- und Methodenentwicklung erleichtert. Im Rahmen des Praktikums sollte eine einfache Ansteuerung des Ultraschall-Phasenarrays realisiert werden. Bisherige Ergebnisse 1. Ansteuerungselektronik Im Praktikum wurden zunächst ein 1-Kanal- und dann ein Mehrkanal-Frequenzgenerator aufgebaut mit • sauberem Sinussignal, • einstellbarer Frequenz, • Festlegung der relativen Phasenlage der einzelnen Kanäle und • gepulste Signalformen. In einer ersten Realisierung wurde ein Arduino-Microcontroller mit einem speziellen Synthesizer-Baustein gekoppelt. Die Frequenz wird dabei auf dem Synthesizer-Baustein generiert. Der Microcontroller dient der Programmierung der Phase und der Pulsform. In einem Aufbau mit zwei Synthesizern (2-Kanal-Frequenzgenerator) wurde die Möglichkeit geschaffen, zwei Kanäle mit einer einstellbaren Phasenverschiebung anzusteuern. Hierzu wurden die Synthesizer über die Programmierung synchronisiert. Der gewählte Synthesizer-Baustein erlaubt die Erzeugung von Frequenzen bis zu 62,5 MHz und ist damit in der Lage, die für die Ultraschall-Anwendung benötigten Frequenzen im Bereich von 1 MHz zur Verfügung zu stellen. Er besteht aus einem 125 MHz-Oszillator und einem internen AD-Wandler. Der Baustein bietet eine Auflösung von 32bit für die Frequenz und 8bit für die Phase. Abbildung 1 zeigt die Hardware des 2-Kanal-Frequenzgenerators. Die Entwicklungen der Schaltung und der Software wurden genauso bei MRC ausgeführt wie die Bestückung der Platine. Abbildung 2 zeigt die Sinussignale der beiden phasenverschobenen Kanäle auf dem Oszilloskop.

Abbildung 1: 2-Kanal-Frequenzgenerator mit Synthesizer-Baustein und Arduino-Microcontroller

Abbildung 2: Oszillogramm zweier gegeneinander phasenverschobener Signussignale mit einer Frequenz von 1 MHz In einer zweiten, auf eine größere Zahl von Kanälen erweiterbaren Realisierung wurde der Arduino-Microcontroller durch einen Microcontroller der Firma Atmel (ATmega2560) ersetzt. Abbildung 3 zeigt diese Hardware-Realisierung auf einer Versuchsplatine. In Abbildung 4 ist eine typische Pulsfolge gezeigt, die mit dieser Elektronik generiert werden kann. Beispielsweise können wie bei der elektronischen Tiefenhirnstimulation mehrere Mikrosekunden lange Pulszüge mit einer Festfrequenz im Bereich von 100 Hz erzeugt werden.

Abbildung 3: Frequenzgenerator mit Synthesizer-Baustein und ATmega2560-Microcontroller

Abbildung 4: Erzeugung eines pulsförmigen Ausgangssignals, das die Pulsform der DBS-Stimulation mit einer festen Pulsfolge simuliert 2. Beschaffung Ultraschall-Phasenarray Mit dem möglichen Hersteller eines Ultraschall-Phasenarrays für Labormessungen wurde eine umfangreiche Kommunikation geführt, bei der insbesondere die Anforderungen ausgetauscht wurden. Die Spezifikation hat großen Einfluss auf den Preis des Arrays, der ohnehin recht hoch ist. Deshalb möchten ein Array anschaffen, mit dem erste Fragen zur Machbarkeit auch tatsächlich geklärt werden können. Die finale Klärung gestaltet sich komplex, sodass bisher noch keine Bestellung vorgenommen werden konnte. Das von der Jörg Bernards-Stiftung zur Verfügung gestellte Budget wurde daher noch nicht ausgeschöpft. Durch einen neuen Kontakt zum Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik in St. Ingbert ergibt sich eine alternative Quelle für ein Phasenarray. Derzeit wird das weitere Vorgehen geklärt. Bisheriger Mitteleinsatz

Question 10

Lokale Ultraschall-vermittelte Cytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.11.2014 bis 31.10.2015

Answer

1. Zielsetzung
Ziel des vorliegenden Projektes ist es die Wirksamkeit und Selektivität der Chemotherapie von Tumorerkrankungen, insbesondere von Hirntumoren, zu verbessern indem Zytostatika in Microbubbles eingekapselt werden die lokal durch fokussierten Ultraschall zum Platzen gebracht werden so daß der Wirkstoff nur im Tumorgewebe freigesetzt wird während eine systemische Aktivität unterbunden ist. 2. Methoden Die Microbubbles sollen nach etablierten Methoden hergestellt und zunächst als sogenannte Dummys (ohne Zytostatika-Beladung) umfassend auf Stabilität, Größen-verteilung und Löslichkeit untersucht werden. Gängige Methoden dafür umfassen unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS) sowie die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie. Wichtige Parameter, die dabei ermittelt werden sollen sind der Einfluß von pH-Wert, Umgebungstemperatur und Licht sowie wiederholter Einfrier-/Auftau-Zyklen und Scherkräfte durch Schütteln bzw. Zentrifugieren auf die Integrität der Bubbles. Weiterhin sollten neue Wirkstoffkandidaten auf der Basis bekannter bioaktiver Platin-Verbindungen hergestellt werden die besonders einfach mit stark hydrophoben Gruppen für die Verankerung in der inneren Microbubble-Membran geeignet sind.
Auf der Basis dieser Daten soll dann in weiteren Projektschritten, für die aktuell eine DFG-Sachbeihilfe beantragt ist, zunächst das toxikologische Profil der Microbubbles mit und ohne Beladung sowie der nach Ultraschall-vermittelter Ruptur verbleibenden Bubble-Bausteine untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei vor allem der Immunokompatibilität dieser mikroskaligen Systeme gelten. Darauf aufbauend sind dann erste in vivo-Studien geplant. Neben einer Demonstration der Wirkstoff-Freisetzung durchUItraschall im lebenden Modellorganismus ist es hier insbesondere auch das Ziel,Bildgebungsmethoden zur in vivo-Visualisierung und zum Tracking der Microbubbles undihrer Bestandteile zu etablieren. 4. Ergebnisse
4.1 Herstellung und Charakterisierung der Microbubbles In der ersten Projektphase seit dem 01.03.2014 wurde im Labor von Prof. Schatzschneider zunächst die Herstellung mit Octafluorpropan gefüllter Microbubbles etabliert wobei das verwendete Verfahren hier nocheinmal in Abb. 1 gezeigt ist, für die weiteren experimentellen Details wird auf den vorherigen Bericht verwiesen.

Abb. 1: Verwendete Methode zur Herstellung der Microbubbles (nach: X. Shuai et al. Int. J. Nanomedicine 2012, 7, 895–904). Die Microbubbles können mittlerweile sehr zuverlässig hergestellt werden, wobei der
Prozess im Bezug auf Größenverteilung und Langzeitstabilität optimiert wurde. Als kritisch stellte sich dabei interessanterweise insbesondere die initiale Filmherstellung heraus. Durch Anfärbung der Bubbles mit 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiIC18) konnten sehr gute Ergebnisse bei der Analyse mittels Fluoreszenzmikroskpie erzielt werden, die im Tumorbiologie-Labor der Neurochirurgischen Klinik und Poliklinik des Universitätsklinikums Würzburg (PD Dr. Carsten Hagemann) durchgeführt werden und gegenüber einfachen lichtmikroskopischen Untersuchungen ein deutlich verbessertes Bild ergeben. In Abb. 2 ist eine solche repräsentative Aufnahme gezeigt aus der vor allem die enge Größenverteilung hervorgeht.

Abb. 2: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme mit DiIC18 angefärbter Microbubbles. 4.2 Zytotoxizitätsuntersuchungen an Glioblastom-Zellen Im Labor von Dr. Hagemann sind mittlerweile die Assays etabliert um die Zytotoxizität der verschiedenen Bubble-Komponenten sowie des Wirkstoffs mit und ohne Einschluß in die Microbubbles zu untersuchen. Dafür kommt der metabolische MTT-Assay zum Einsatz, der auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumfarbstoffs beruht, welcher von lebenden Zellen mit aktiven Mitochondrien zu einem blau-violetten Formazan reduziert wird. Die Stärke der Färbung korreliert dabei mit der Zahl der lebenden Zellen und nimmt mit der zytotoxischen Wirkung einer applizierten Substanz konzentrationsabhängig ab.
Tests mit zwei Platinverbindungen, dem etablierten Antitumor-Wirkstoffs Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2) und dem bekanntermaßen inaktiven Kaliumtetrachloroplatinat (K2[PtCl4]) ergaben die erwarteten Ergebnisse und zeigen die Funktionsfähigkeit des Assays an. In einem zweiten Schritt wurden dann die Lipidbausteine der Microbubbles getestet um, obwohl erwartet, deren Unbedenklichkeit auch experimentell zu verifizieren. Im Labor von Prof. Schatzschneider arbeitet Frau Mawamba zur Zeit an der Herstellung neuer Platin-basierter Wirkstoffkandidaten mit langen, hydrophoben Alkylketten die eine Integration in die Bubble-Membran ermöglichen sollen. Erste Verbindungen stehen mittlerweile für die biologischen Tests bereit.
Bis zum Jahresende soll nun ein Verfahren zur Beladung der Microbubbles mit dem organischen Wirkstoff Temozolomid etabliert werden, was insbesondere die Entwicklung einer Method zur HPLC(high-pressure liquid chromatography)-Bestimmung dieser Substanz in der Bubble-Phase und der überstehenden Lösung erfordert, während die Anlagerung Metall-basierten Wirkstoffkandidaten direkt über Messung des Platingehalts mittels ICP-MS oder AAS verfolgt werden soll. 4.3 DFG-Antrag Basierenden auf den mit Hilfe der Förderung durch die Jörg-Bernards-Stiftung durchgeführten Vorarbeiten konnte am 30.04.2015 der Antrag auf Sachbeihilfe für das Projekt "Lokale Freisetzung zytotoxischer Wirkstoffe zur Behandlung maligner Gliome unter Verwendung von fokussiertem Ultraschall" bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) eingereicht werden. Projektverantwortliche sind PD Dr. Carsten Hagemann (Neurochirurigsche Klinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Würzburg) und Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider (Institut für Anorganische Chemie, Universität Würzburg) mit PD Dr. Mario Löhr und Prof. Dr. Volker Sturm als weiteren Mitantragstellern. In insgesamt vier Arbeitspaketen (work packages, WPs) sollen über 36 Monate Laufzeit die Bubble-Herstellung und Beladung mit Wirkstoffen (WP1), die Bubble-Stabilität und Ultraschall-vermittelte Wirkstofffreisetzung (WP2) sowie die biologische Wirkung mit und ohne Ultraschall auf Glioblastom-Zellen in in vitro 2D- und 3D-Zellkulturen (WP3+4) untersucht werden. Die Gutachten liegen der DFG mittlerweile vor und mit einer Entscheidung des zuständigen Fachkollegiums wird im 1. Quartal 2016 gerechnet. 4.4 Ausblick Mit der erfolgreichen und reproduzierbaren Herstellung der Microbubbles sowie der Etablierung der in vitro-Zytotoxizitätsassays stehen nun prinzipiell alle Materialien und Methoden zur Verfügung um die differentielle Wirkung der beladenen Microbubbles mit und ohne Ultraschallwirkung zu untersuchen.
Wesentliches Hindernis für den weiteren Projektfortschritt ist aktuell jedoch des Fehlen eines Ultraschall-Transducers mit Kosten in Höhe von ca. € 33.500,- (Angebot des Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik IBMT in St. Ingbert, Preis inkl. MwSt.). Die Mittel für dieses essentielle Gerät sind zwar in dem DFG-Antrag enthalten (vide supra), werden aber selbst bei positiver Begutachtung vermutlich frühestens Mitte 2016 zur Verfügung stehen. Zwar soll in der Zwischenzeit versucht werden die Microbubbles durch andere Mechanismen zum Platzen zu bringen (Hitzeeinwirkung, starke Scherkräfte), dabei ist jedoch mit negativen Einflüsse auf den eingeschlossenen Wirkstoff, insbesondere bei erhöhten Temperaturen, zu rechnen und das Ziel des Projekts ist ja die zytotoxische Wirkung durch fokussierten Ultraschall zu lokalisieren.
Weiterhin wünschenswert wäre ein einfaches, gebrauchtes klinisches Ultraschallgerät, über das die Microbubbles über ihren differentiellen Kontrast relativ zum Medium direkt nachgewiesen werden könnte um ihre Stabilität in Modellsystemen für Blutgefäße untersuchen zu können. 5. Ausgaben
Für das Projekt standen auf Antrag vom 08.12.2014 im Berichtszeitraum zuzüglich der Deckung der restlichen Personalausgaben Mittel in Höhe von insgesamt € 7.500,- zur Verfügung, wobei von diesem Ansatz € 6.500,- für Sachkosten und € 1.000,- für Reisemittel vorgesehen waren. Als verantwortliche Mitarbeiterin ist seit 01.03.2014 Frau Vivane Mawamba (Bachelor Chemie Universität Jaunde I, Kamerun; Master Chemie TU Clausthal) nach TV-L 13 50% beschäftigt, die weiterhin herausragende Arbeit leistet. Besonders hervorzuheben ist dabei die ausgezeichnete Zusammenarbeit mit den Mitarbeiter/inne/n im Labor von Herrn PD Dr. Hagemann, in dem Frau Mawamba mittlerweile regelmäßig mikroskopische Untersuchungen zur Stabilität der Microbubbles durchführt. Frau Mawamba wird seit dem 01.03.2015 über eine Hausstelle aus den Berufungsmitteln von Herrn Prof. Schatzschneider finanziert, aus der ihre Stelle bis zur einer Promotionshöchstdauer von vier Jahren weiterfinanziert wird. Im Bereich der Sachmittel wurden im wesentlichen Basischemikalien beschafft (Sigma-Aldrich, Serva und Strem: € 2.595,94-). Zudem wurden einige Ersatzteile für defekte Laborgeräte benötigt (Evoqua und HekaTech: € 1.016,86-). Weitere sächliche Auslagen an die Firma MRC Systems GmbH in Heidelberg (€ 4.424,35-) werden von Prof. Sturm separat nachgewiesen. Reisekosten fielen in 2015 nicht an da die Teilnahme von Frau Mawamba und Prof. Schatzschneider am "European Molecular Imaging Meeting" (EMIM) in Tübingen (18. bis 20.03.2015) durch die COST Action TD1004 "Theranostics Imaging and Therapy" finanziert wurde, ebenso wie die Präsentation von Prof. Schatzschneider auf dem COST TD1004 Closing Meeting in Belgrad (10./11.09.2015). Diese Mittel wurden daher zur Deckung des erweiteren Sachmittelbedarfs herangezogen. Insgesamt wird dadurch für den Projektzeitraum 01.11.2014 bis 31.03.2016 ein Fehlbetrag in Höhe von € 4.119,67- erwartet, der im wesentlichen auf die unerwarteten Auslagen für die Fa. MRC Systems zurückzuführen ist. Für einen entsprechenden Ausgleich wären wir sehr dankbar.

Würzburg, 08.11.2013 Ulrich Schatzschneider

Question 11

Cytostatika-Applikation, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.03. bis 30.11.2014

Answer

1. Zielsetzung Ziel des vorliegenden Projektes ist es die Wirksamkeit und Selektivität der Chemotherapie von Tumorerkrankungen, insbesondere von Hirntumoren, zu verbessern indem Cytostatika in Microbubbles eingekapselt werden die lokal durch fokussierten Ultraschall zum Platzen gebracht werden so daß der Wirkstoff nur im Tumorgewebe freigesetzt wird während eine systemische Aktivität unterbunden ist. 2. Methoden Die Microbubbles sollten nach etablierten Methoden hergestellt und zunächst als sogenannte Dummys (ohne Cytostatika-Beladung) umfassend auf Stabilität, Größen-verteilung und Löslichkeit untersucht werden. Gängige Methoden dafür umfassen unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS) sowie die Lichtmikroskopie. Wichtige Parameter, die dabei ermittelt werden sollen sind der Einfluß von pH-Wert, Umgebungs-temperatur und Licht sowie wiederholter Einfrier-/Auftau-Zyklen und Scherkräfte durch Schütteln bzw. Zentrifugieren auf die Integrität der Bubbles. Weiterhin sollten neue Wirkstoffkandidaten auf der Basis bekannter bioaktiver Platin-Verbindungen hergestellt werden die besonders einfach mit stark hydrophoben Gruppen für die Verankerung in der inneren Microbubble-Membran geeignet sind. Auf der Basis dieser Daten soll dann in weiteren Projektschritten, für die aktuell eine DFG-Förderung beantragt wird, zunächst das toxikologische Profil der Microbubbles mit und ohne Beladung sowie der nach Ultraschall-vermittelter Ruptur verbleibenden Bubble-Bausteine untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei vor allem der Immunokompatibilität dieser mikroskaligen Systeme gelten. Darauf aufbauend sind dann erste in vivo-Studien geplant. Neben einer Demonstration der Wirkstoff-Freisetzung durch UItraschall im lebenden Modellorganismus ist es hier insbesondere auch das Ziel, Bildgebungsmethoden zur in vivo-Visualisierung und zum Tracking der Microbubbles und ihrer Bestandteile zu etablieren. 4. Ergebnisse Das Projekt startete am 01.03.2014 mit der Einstellung von Frau Viviane Mawamba als Doktorandin nach TVL13 50%. Sie verfügt über einen Hintergrund aus dem Bereich der bioabbaubaren Polymere und hat sich seitdem hervorragend in die Arbeitsgruppe eingefügt. Nach einer eingehenden Literaturrecherche wurde entschieden für die Synthese der Microbubbles die thin-film hydration-sonication-Method zu verwenden (Abb. 1).1 Dabei wird eine Phospholipid-Mischung (DPPC, DPPA und PEG2000-DSPE) in Chlorofom gelöst und nach Abdampfen des organischen Lösemittels ein Lipidfilm gebildet. Dieser wird dann bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (beschafft aus Projektmitteln) hydratisiert, wobei sich Liposomen bilden. Eine Suspension dieses Materials wird dann in einem Zentrifugen-röhrchen unter einer Atmosphäre von Octafluorpropan als Füllgas mit einem Ultraschall- Homogenisator (ebenfalls beschafft aus Projektmitteln) beschallt, wobei sich die Microbubbles bilden. Durch differentielle Zentrifugation können die verschiedenen Bubble- Fraktionen dann getrennt werden.2 Die Charakterisierung erfolgt im eigenen Labor mittels Lichtmikroskopie mit einer USB-Kamera zur Dokumentation sowie durch Dynamische Lichtstreuung (DLS) in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Anke Krüger ( Institut für Organische Chemie, Universität Würzburg).

Abb. 1: Verwendete Methode zur Synthese der Microbubbles (nach: X. Shuai et al. Int. J. Nanomedicine 2012, 7, 895–904). Der Beginn der Microbubble-Herstellung wurde dabei durch die unerwartet lange Lieferzeit für die Lipide (bezogen über Distributor Otto Nordwald von Avanti Polar Lipid, Alabaster, Alabama, USA) und das Octafluorpropan (Linde Spezialgase) erheblich verzögert. Durch regelmäßiges Verwiegen insbesondere der Gasflasche wird jedoch der Verbrauch an Ausgangsmaterialien nunmehr kontinuierlich fortgeschrieben so daß in Zukunft frühzeitig Ersatz bestellt werden kann. Für die Herstellung der Microbubbles unter Octafluorpropan-Atmosphäre wurde von Frau Mawamba ein Aufbau konstruiert der den Verbrauch an Lipiden wie an Füllgas minimiert. Bereits im ersten Versuch konnten Microbubbles erhalten werden die mit Lichtmikroskopie charakterisiert wurden. Mit dem vorhandenen Gerät (VisiScope BL224 PI mit 10 Megapixel USB-Kamera VisiCam) können dabei Bubbles bis zu einem Durchmesser von etwa 1 μm sicher identifiziert werden (Abb. 2a), für die noch kleineren Nanobubbles (d < 1 μm) reicht das Auflösungsvermögen unseres Mikroskops jedoch nichtmehr aus. Hier soll im neuen Jahr nach Markierung der Bubbles mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Dil, 1,1′-Dioctadecyl- 3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat) ein kürzlich im Labor von Dr. Carsten Hagemann (Neurochirurgische Klinik und Poliklinik, Universitäts-klinikum Würzburg) installierstes konfokales Fluoreszenzmikroskop mit wesentlich höherer Auflösung zur Charakterisierung herangezogen werden. Als kritischer Parameter für die Isolierung der Microbubbles mit einer möglichst reproduzierbaren und engen Größenverteilung stellte sich dabei der Zentrifugationsschritt heraus. Weiterhin ergaben Messungen daß es bei der Ultraschall-Applikation im Homogenisator abhängig von Dauer und Amplitude zu einem erheblichen Energieeintrag in die Suspension kommt. So steigt bei einer Ultraschall-Applikation für nur 5 min bei einer Amplitude von 50 % die Temperatur um fast 25 °C von Raumtemperatur auf über 50 °C an. Da die Bubbles abhängig von der Temperatur "reifen" ist eine sorgfältige Kontrolle auch dieses Parameters gefragt. Möglicherweise spielt dieser auch bei dem Zentrifugations-schritt eine Rolle, da die verwendeten Rotoren über keine Temperaturkontrolle verfügen, eine Messung ist jedoch schwierig.

Abb. 2: a) Lichtmikroskopische Aufnahme der ersten im Rahmen des Projekts hergestellten Microbubbles (40fache Vergrößerung) und b) Cisplatin-Derivat mit C16-Alkylketten als Membran-affines Wirkstoffderivat. Parallel zur Bubble-Herstellung und Charakterisierung hat Frau Mawamba auch damit begonnen, Derivate des etablierten Antitumor-Wirkstoffs Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2) herzustellen die über langkettige Alkylgruppen verfügen um so eine hohe Membran-Affinität sicherzustellen (Abb. 2b). Trotz anfänglicher erheblicher Verzögerung die durch die lange Lieferzeit der benötigten Materialien bedingt war ist das Projekt jedoch insgesamt sehr gut gestartet. Die ein-gestellte Mitarbeiterin hat alle Erwartungen sogar noch übertroffen, sich hervorragend in das Projekt eingearbeitet und auch sehr gut in die Arbeitsgruppe eingefügt. Es wurde eine Aufbau für die Herstellung der Microbubbles konstruiert und kritische Parameter für eine reproduzierbare und enge Größenverteilung ermittelt. Die ersten hergestellten Bubbles zeigen den gewünschten Durchmesser im unteren Mikrometer-Bereich und werden nun für eine weitergehende Charakterisierung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie mit einem Farbstoff markiert. Außerdem wurden erste Schritte hin zu Membran-affinen metallbasierten Wirkstoffkandidaten unternommen. Somit konnten alle wesentlichen Projektziele erreicht werden. In der nun folgenden Projektphase steht insbesondere die Etablierung der Zellkultur-Assays im Vordergrund sowie die Integration eines Systems für die Ultraschall-vermittelte Ruptur der Microbubbles um deren differentielle Wirkung auf Tumorzellkulturen mit und ohne Ultraschall-Einwirkung untersuchen zu können. 5. Ausgaben Für das Projekt standen auf Antrag vom 08.11.2013 Mittel in Höhe von insgesamt € 37.500,- zur Verfügung, wobei von diesem Ansatz € 30.000,- für Personalkosten und € 7.500,- für Sachmittel vorgesehen waren. Als Mitarbeiterin in dem Projekt wurde zum 01.03.2014 Frau Vivane Mawamba (Bachelor Chemie Universität Jaunde I, Kamerun; Master Chemie TU Clausthal) eingestellt die mit einem Hintergrund aus dem Bereich bioabbaubare Polymere über den passenden Hintergrund für das Vorhaben verfügt und sich seitdem hervorragend in die Arbeitsgruppe eingefügt hat. Die Personalkosten für die Monate März bis Oktober 2014 beliefen sich auf € 16.701,20- was bei einer Laufzeit von acht Monaten einem Betrag von € 2.087,65- pro Monat entspricht. Für die gesamte Projektdauer werden daher Personalausgaben in Höhe von € 25.051,80- zzgl. der Jahressonderleistung in Form von Weihnachtsgeld erwartet und der Personalansatz somit vermutlich geringfügig unterschritten. Frau Mawamba wird ab 01.03.2015 über eine Hausstelle aus den Berufungsmitteln von Herrn Prof. Schatzschneider bis zur einer Promotionshöchstdauer von 4 Jahren weiterfinanziert werden. Im Bereich der Sachmittel waren für die Herstellung der Microbubbles insbesondere die Beschaffung eines Schüttelinkubators (VWR: € 1.431,57-) und eines Ultraschall-Generators (Zinsser Analytics: € 3.263,81-) erforderlich. Weitere wesentliche Positionen stellten die Lipide für das Microbubble-Hüllmaterial (Avanti Polar Lipids durch Distributor Otto Nordwald: € 733,04-) und als Microbubble-Füllmaterial Octafluorpropan (Linde Spezialgase: € 956,28-) dar. Der Restbetrag verteilte sich dann auf weiteres Laborkleingerät sowie Basischemikalien (VWR, Sigma und Hartenstein: € 1.065,00-). Weitere sächliche Auslagen an die Firma MRC Systems GmbH in Heidelberg (€ 6.417,88-) werden von Prof. Sturm separat nachgewiesen. Reisekosten fielen in 2014 nicht an da die Teilnahme von Frau Mawamba an dem COST Action TD1004 "Theranostics Imaging and Therapy" Annual Meeting in Istanbul (03. und 04.10.2014), an dem sie sich einen Vortrag zum Thema "Microbubbles as drug carriers" beteiligt hat, und der 3. NanoFar Autumn School an der Université catholique de Louvain in Brüssel (20.–24.10.2014) dankenswerterweise von COST TD1004 erstattet wurden. Diese Mittel wurden daher zur Deckung des erweiteren Sachmittelbedarfs herangezogen. Insgesamt wird so für die Projektlaufzeit 01.03.2014 bis 28.02.2015 ein Fehlbetrag in Höhe von € 1.419,38- zzgl. des Betrags für die Weihnachtssonderzahlung, voraussichtlich insgesamt € 2.500,- erwartet, der im wesentlichen auf die unerwarteten Auslagen für die Fa. MRC Systems zurückzuführen ist. Für einen entsprechenden Ausgleich wären wir sehr dankbar.

Würzburg, 08.11.2013 Ulrich Schatzschneider

Question 12

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Answer

Im Tumorbiologie-Labor des Universitätsklinikums Würzburg in Kooperation mit dem Institut für Anorganische Chemie der Universität Würzburg Einen Einblick in typische Arbeitsschritte im Tumorbiologie-Labor der Universität Würzburg geben die beiden Fotos oben. Links analysiert der Biochemie-Student Wilfrid Dzokou auf dem Laptop Wachstumskurven von Krebszellen für seine Bachelorarbeit während rechts die Technische Laborassistentin Elisabeth Karl das xCELLigence-Gerät mit neuen Zellkulturplatten belädt. Anschließend wird die Tür des Brutschranks geschlossen um die Zellen unter konstanten Bedingungen, insbesondere bei 37 °C wie im menschlichen Körper, wachsen zu lassen.

Unten das Projektteam (von links nach rechts): Viviane Mawamba, Doktorandin am Institut für Anorganische Chemie, Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider, Leiter chemische Synthese und Microbubble-Herstellung, Priv.-Doz. Dr. Carsten Hagemann, Leiter des Tumorbiologie-Labors, Priv.-Doz. Dr. Mario Löhr und Prof. Dr. Volker Sturm, Leitung des ärztlichen Teams.

Elektronisch angesteuerte Transducer-Elemente erlauben die Fokussierung des Ultraschalls auf den Tumor

Durch sogenannte "phased array transducer", wie sie auch in der modernen Radartechnik zum Einsatz kommen, kann der Ultraschall alleine durch elektronische Ansteuerung der Transducer-Elemente in bestimmte Richtungen gelenkt werden. Für therapeutische Anwendungen ist daher geplant die Transducer in einem Helm zu fixieren so daß ihre Anordnung relativ zum Tumor auch bei Kopfbewegungen des Patienten konstant bleibt. Anhand von Tomographie-Bildern wird dann festgelegt welche Gehirn-Bereiche wie lange und wie intensiv dem fokussierten Ultraschall ausgesetzt werden sollen um die im Blutstrom zirkulierenden Microbubbles zum Platzen zu bringen und den enthaltenen Wirkstoff lokal freizusetzen. Dabei werden auch Unregelmäßigkeiten in der Struktur des Schädelknochens berücksichtigt.Anders als beispielsweise radioaktive Strahlung ist Ultraschall gesundheitlich unbedenklich und hat keinen schädlichen Einfluss auf das ebenfalls durchstrahlte gesunde Gewebe. Der verwendete Ultraschall ist dabei sehr ähnlich dem schon seit langem z.B. bei Schwangerschaftsuntersuchungen verwendeten.Die Abbildung zeigt die Aufnahme eines Gehirntumors (weiß umrandete Fläche in der oberen linken Kopfhälfte) mit der schematischen Darstellung zweier Transducer-Elemente und unterschiedlich abgestrahltem Ultraschall. Ultraschall-Behandlung bringt die Microbubbles zum Platzen und verwandelt die milchige Suspension in eine klare Lösung

Ultraschall bringt die Microbubbles zum Platzen Die Abbildung zeigt eine Suspension der Microbubbles in wässriger Lösung (links) vor und (rechts) nach Beschallung mit Ultraschall. Die Bubbles sind zu klein um sie ohne Mikroskop mit dem bloßen Auge erkennen zu können, ihre Lösungen erscheinen jedoch milchig, ganz wie bei Kuhmilch, die ebenfalls aus Fetttröpfchen in Wasser besteht. Durch die Einwirkung des Ultraschalls zerplatzen die Bubbles und zerfallen in ihre Bestandteile, die zu klein sind um noch Licht zu streuen. Daher ist die Ultraschall-behandelte Lösung klar. Mit einem Farbstoff markierte Microbubbles leuchten im Mikroskop und lassen die Bläschen erkennen die 50x kleiner sind als der Durchmesser eines menschlichen Haars.

Die Abbildung zeigt Microbubbles in deren Hülle ein Fluoreszenz-Farbstoff eingebettet ist. Dieser beginnt beim Anstrahlen im Mikroskop zu leuchten und macht so die Bläschen sichtbar. Mit einem Durchmesser von nur etwa einem Mikrometer (1 µm) sind die Microbubbles etwa 50x dünner als der Querschnitt eines menschlichen Haars und damit so klein daß sie auch durch die Kapillargefäße des menschlichen Blutkreislaufs wandern können ohne diese zu verstopfen. Die Hülle der Microbubbles besteht aus Lipid-Bausteinen ähnlich der Wand menschlicher Zellen und ist daher ebenso wie das Füllgas gesundheitlich unbedenklich. Nach dem Zerplatzen der Bubbles wird das ohnehin nur in geringsten Mengen aufgenommene Füllgas vermutlich über die Lungen wieder abgeatmet. In die lipophile, fettartige Hülle der Microbubbles können medizinische Wirkstoffe eingelagert werden, die so vor unspezifischen negativen Wechselwirkungen mit dem Körper geschützt sind, was die bekannten Nebenwirkungen einer Chemotherapie lindern soll. Erst im Tumor soll das Medikament dann durch Ultraschall-vermitteltes lokalisiertes Zerplatzen der Bubbles freigesetzt werden und seine Wirkung entfalten. Microbubbles und ihre Bausteine sind biologisch unbedenklich, Platin-basierte Wirkstoffe töten dagegen Krebszellen ab

Die biologische Wirkung einer chemischen Verbindung kann durch den MTT-Assay gemessen werden. Dieser beruht darauf daß lebende Zellen einen gelben Farbstoff zu einer violetten Verbindung reduzieren. Je weniger stark violett eine Zellkultur ist desto weniger lebende Zellen enthält diese, was in der Regel auf einer Skala von 0 bis 1 (entsprechend 0–100%) relativ zu unbehandelten Zellen angeben ist. Die Abbildung zeigt a) die vernachlässigbare Wirkung der Lipid-Bausteine (DPPA, DPPC, DSPE-PEG) der Microbubbles relativ zu eine Kontrollprobe sowie b) die gewünschte Inaktivität der intakten Microbubbles bis zu einer Millionen Bläschen pro Milliliter. Demgegenüber führt eine Behandlung mit c) Cisplatin, ein in der Chemotherapie insbesondere von Hodenkrebs sehr erfolgreich eingesetzter Wirkstoff, zu einer signifikanten Reduktion der Zahl der lebenden Zellen. Da Cisplatin nicht lipophil genug ist um in die Hülle der Microbubbles eingebaut zu werden wurde d) eine weitere experimentelle Substanz VM-046-01 hergestellt die über einen seifenartigen "Schwanz" verfügt mit dem sie sich an die Bubbles anlagern soll und die ebenfalls wirksam gegen die Hirntumorzellen ist. Projektziele: Die Untersuchungen wurden bisher ausschließlich aus Zuwendungen der Jörg Bernards-Stiftung, sowie aus Eigenmitteln der Klinik für Neurochirurgie des Universitätsklinikums und des Instituts für Anorganische Chemie der Universität Würzburg finanziert. Die oben skizzierten Zwischenergebnisse sind positiv. Die für den bisherigen Projektverlauf avisierten Ziele sind erreicht. Wir sehen damit gute Chancen, in den nächsten 2 bis
3 Jahren eine zumindest im Tierversuch einsetzbare Methodik zur verbesserten, d.h. lokalen Chemotherapie bösartiger Hirntumoren, sowie im nächsten Schritt auch bestimmter anderer Krebserkrankungen wie Mamma- und Prostatakarzinomen zu entwickeln. Dier hierzu notwendigen chemischen und biologischen Experimente können mit überschaubaren Mitteln realisiert werden. Dies schließt die Entwicklung und Anwendung einfacher, allerdings nur in Laborversuchen verwendbarer Ultraschall-Systeme ein. Ein wesentliches Zwischenziel war die aus Stiftungsmitteln finanzierte Konstruktion des bislang verwendeten Ultraschall-Systems, das für die weiterführenden Versuche noch modifiziert werden muss. Ziel ist der erfolgreiche Abschluss der chemischen und biologischen Entwicklungen, d.h. die Demonstration der erhöhten Wirksamkeit und Verträglichkeit des neuen Verfahrens. Nach der Ablehnung des vom DKFZ Heidelberg koordinierten interdisziplinären Projektes zur Entwicklung eines klinisch einsetzbaren Ultraschall-Systems ist es sehr fraglich, ob dieses Ziel erreichbar ist. Wir werden diese Problematik mit den Projektteilnehmern (insbesondere DKFZ Heidelberg und Fraunhofer Institut St. Ingbert und Kaiserslautern) diskutieren. Sollte dieses Projekt nicht finanzierbar sein, müsste das von uns in Würzburg entwickelte Verfahren industriellen Partnern zur Verfügung gestellt werden, um die Einführung in die Klinik zu ermöglichen. Für eine weitere Förderung des Würzburger Projektes wären wir sehr dankbar. Eine Abschätzung des Finanzbedarfes werden wir in Kürze nachreichen.

ZIELGERICHTET UND EFFEKTIV

DIE FÖRDERPROJEKTE DER JÖRG BERNARDS-STIFTUNG

PROJEKTÜBERSICHT

MIT MIKROBUBBLES
GEGEN KREBSZELLEN

ATLAS OF THE
HUMAN BRAIN

ULTRASCHALL-INDUZIERTE
TUMORBEHANDLUNG

IM GEHIRN MEHR
SEHEN UND ERKENNEN

PROJEKT SEIT 2017

MIT MIKROBUBBLES
GEGEN KREBSZELLEN

Lokale Ultraschall-vermittelte Cytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.11.2014 bis 31.10.2015

Cytostatika-Applikation, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.03. bis 30.11.2014

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PROJEKT SEIT 2015

ATLAS OF THE
HUMAN BRAIN

Lokale Ultraschall-vermittelte Cytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.11.2014 bis 31.10.2015

Cytostatika-Applikation, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.03. bis 30.11.2014

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PROJEKT SEIT 2014

ULTRASCHALL-INDUZIERTE
TUMORBEHANDLUNG

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Ultraschall-induzierte Tumorbehandlung 30.11.2014

Ultraschall-induzierte Tumorbehandlung 05.05.2014

PROJEKT SEIT 2012

IM GEHIRN MEHR
SEHEN UND ERKENNEN

Lokale Ultraschall-vermittelte Cytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.11.2014 bis 31.10.2015

Cytostatika-Applikation, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.03. bis 30.11.2014

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ZIELGERICHTET UND EFFEKTIV

DIE FÖRDERPROJEKTE DER JÖRG BERNARDS-STIFTUNG

PROJEKTÜBERSICHT

MIT MIKROBUBBLES GEGEN KREBSZELLEN

ATLAS OF THE HUMAN BRAIN

ULTRASCHALL-INDUZIERTE TUMORBEHANDLUNG

IM GEHIRN MEHR SEHEN UND ERKENNEN

PROJEKT SEIT 2017

MIT MIKROBUBBLES GEGEN KREBSZELLEN

Lokale Ultraschall-vermittelte Cytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.11.2014 bis 31.10.2015

Cytostatika-Applikation, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.03. bis 30.11.2014

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PROJEKT SEIT 2015

ATLAS OF THE HUMAN BRAIN

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Cytostatika-Applikation, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.03. bis 30.11.2014

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PROJEKT SEIT 2014

ULTRASCHALL-INDUZIERTE TUMORBEHANDLUNG

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Ultraschall-induzierte Tumorbehandlung 30.11.2014

Ultraschall-induzierte Tumorbehandlung 05.05.2014

PROJEKT SEIT 2012

IM GEHIRN MEHR SEHEN UND ERKENNEN

Lokale Ultraschall-vermittelte Cytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.11.2014 bis 31.10.2015

Cytostatika-Applikation, Zwischenbericht für den Zeitraum 01.03. bis 30.11.2014

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GEGEN KREBSZELLEN

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HUMAN BRAIN

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TUMORBEHANDLUNG

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