„Es ist daher dringend erforderlich, effektivere und gezieltere Behandlungsmethoden zu entwickeln und hierdurch sowohl die Prognose als auch die Lebensqualität der Patienten während der Behandlung zu verbessern“, sagt Prof. Dr. Ralf-Ingo Ernestus.

Basierend auf einer Idee aus Köln

Der Direktor der Neurochirurgischen Klinik und Poliklinik des Uniklinikums Würzburg (UKW) initiierte dazu zusammen mit Prof. Dr. Volker Sturm, emeritierter Lehrstuhlinhaber für Stereotaxie und funktionelle Neurochirurgie der Uniklinik Köln und Seniorprofessor an der Neurochirurgischen Klinik in Würzburg, im Jahr 2014 ein interdisziplinäres Projekt für eine möglichst lokale Tumortherapie. Die grundlegende Idee reicht viele Jahre in die Zeit der früheren Zusammenarbeit der beiden Neurochirurgen in Köln zurück. In Würzburg arbeiten an dem Forschungsvorhaben aktuell die Arbeitsgruppen des Chemikers Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider von der Bioanorganischen Chemie der Universität Würzburg, des Leitenden Oberarztes der Würzburger Neurochirurgie, Privatdozent Dr. Mario Löhr, sowie des Molekularbiologen Privatdozent Dr. Carsten Hagemann, Leiter des Tumorbiologischen Labors der Neurochirurgischen Klinik.

Microbubbles als potenzielle Vehikel für Chemotherapeutika

Bei dem ambitionierten Projekt geht es darum, mikroskopisch kleine Bläschen, sogenannte Microbubbles, zu entwickeln und diese mit gegen das Glioblastom gerichteten Chemotherapeutika zu beladen. Die Microbubbles sollen später den Patienten in den Blutkreislauf injiziert werden, wobei die Chemotherapeutika innerhalb der Bläschen so stabil verankert sind, dass sie keine Nebenwirkungen entfalten. Gelangen sie aber mit dem Blutstrom in den Tumor, sollen sie dort durch fokussierten Ultraschall mit hoher Präzision zum Platzen gebracht werden. „Auf diesem Weg wird der Wirkstoff gezielt und ausschließlich innerhalb des Tumors freigesetzt“, schildert Dr. Hagemann. Besonders attraktiv ist dieses Behandlungskonzept nach seinen Worten auch dadurch, dass der Ultraschall auf dem Weg zum Wirkungsort das gesunde Gewebe nicht schädigt. Soweit das Fernziel. Bis es soweit sein wird, ist noch viel Entwicklungsarbeit nötig. Über erste Erfolge kann die Forschergruppe schon berichten: In der Bioanorganischen Chemie konnten die Microbubbles bereits erfolgreich hergestellt und mit Therapeutika beladen werden.

Zukünftig sollen die Microbubblesmit Chemotherapeutika beladen werden, um sie dann dem Patienten intravenös zu injizieren. Die Microbubblesgelangen über den natürlichen Blutstrom ins Gehirn zum Ort des Glioblastoms, wo sie mittels fokussiertem Ultraschall durch einen Transducerhelm zum Platzen gebracht werden. So wird der Wirkstoff lokal gezielt freigesetzt und kann gegen den Tumor wirken ohne große Nebenwirkungen zu zeigen.

Biologin testet jetzt in Zellkulturmodellen

Nun tritt das Projekt in ein neues Stadium ein: Die Wirksamkeit und die Verträglichkeit der Microbubbles sollen im Tumorbiologischen Labor an Zellkulturen getestet werden. Dazu ist die Biologin Ellina Schulz zum Team gestoßen, die ihr Biologiestudium in Würzburg mit den Schwerpunkten Molekular- und Zellbiologie absolvierte. Bereits während ihrer Masterarbeit im Forschungslabor der Hautklinik des UKW entwickelte sie großes Interesse an der klinischen Tumorforschung. Die Arbeit an dem höchst innovativen Projekt stellt daher eine konsequente Weiterführung ihrer bisherigen wissenschaftlichen Arbeit dar und ist nun zentraler Bestandteil ihrer dreijährigen Promotionsarbeit. Hierbei wird sie vor allem die Microbubbles in 2D- und 3D-Zellkulturmodellen auf ihre Verwendbarkeit, Stabilität und Wirksamkeit ausgiebig testen.

Links: Vor der Ultraschallbehandlung war die Lösung milchig, da die Microbubbles aus Lipiden (Fetten) besteht. Rechts: Nach der Ultraschallbehandlung klarte die Lösung im Bereich des Ultraschallsstrahls (rot) auf, da die Microbubbles zerplatzten und die Lipide freigesetzt haben.

Gefördert von der der Jörg-Bernards-Stiftung

Finanziert werden diese Arbeiten von der Jörg-Bernards-Stiftung aus Köln. Unter dem Leitfaden „Gedenken. Forschung. Zukunft.“ unterstützt die von dem Ehepaar Marianne und Helmut Bernards gegründete Stiftung seit dem Jahr 2007 Forschungsarbeiten zur Bekämpfung von Hirntumoren – in Gedenken an ihren Sohn, der an einem Glioblastom

verstorben ist.

Prof. Dr. Ralf-Ingo Ernestus, der Direktor der Neurochirurgischen Klinik des Uniklinikums Würzburg (links), und die Würzburger Microbubbles-Arbeitsgruppe: Privatdozent Dr. Carsten Hagemann, Ellina Schulz, Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider und Privatdozent Dr. Mario Löhr (von links). Bild: Doris Krammel / Uniklinikum Würzburg

Die Jörg-Bernards-Stiftung hat mit Schreiben vom 20.10.2017 die Förderung des Projektantrages „Lokale Ultraschall-vermittelte Zytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren: Von der Zellkultur zum Tierversuch“ in Höhe von 180.000 € über 3 Jahre bewilligt. Mit der Einstellung der Biologie-Doktorandin Frau Ellina Schulz im Mai 2018 konnte die Bearbeitung der im untenstehenden Gantt-Diagramm zusammengefassten Arbeitspakete begonnen werden. Im Oktober 2021 wurde das Projekt experimentell abgeschlossen.

In den ersten 1,5 Jahren wurde die Herstellung der Microbubbles optimiert, so dass diese über viele Stunden stabil und verwendbar gehalten werden können. Diverse Platin- und Palladiumverbindungen wurden synthetisiert und an Glioblastomzellen getestet (Arbeitspaket 1). Die Beladung von Microbubbles mit dem Chemotherapeutikum Paclitaxel konnte nachgewiesen werden, wie auch die

Freisetzung und Wirkung dieses Chemotherapeutikums nach Ultraschallapplikation. Im Zentrum von Arbeitspaket 2 stand der Transfer der Experimente von einfachen 2D-Gewebekulturen auf anspruchsvolle 3D Tumormodelle, die von Frau Schulz im Labor etabliert und optimiert wurden. Frau Schulz ist es gelungen, sogenannte organotypische hippocampale slice Kulturen (OHSC) anzulegen und mit Tumorzellen zu beimpfen, die dann Mikrotumoren gebildet haben. Diese Ergebnisse wurden im Halbzeitbericht vom 06.12.2019 zusammengefasst und werden daher hier nicht ausführlich wiederholt. Insgesamt wurden Arbeitspaket 1 und Meilensteine 1 und 2 fristgerecht abgeschlossen und mit Arbeitspaket 2 wurde im Jahr 2019 begonnen.

Trotz einer mehrmonatigen Laborschließung wegen der COVID-19 Pandemie konnten die Arbeiten im Jahr 2020 weitergeführt werden. Die Methode zur Synthese und Aufreinigung von Microbubbles wurde noch einmal überarbeitet und deutlich verbessert. Auch wurde mit Doxorubicin ein Therapeutikum gefunden, welches auf Grund seiner Autofluoreszenz noch besser nachweisbar ist und die Etablierung der 3D Tumormodelle wurde weiter vorangetrieben. Damit wurde Arbeitspaket 2 nahezu abgeschlossen. Die Ergebnisse wurden der Jörg-Bernards-Stiftung in einem Bericht vom 18.12.2020 ausführlich dargelegt.

Im Jahr 2021 wurde das Projekt nicht nur planmäßig fortgeführt, sondern auch erfolgreich experimentell zum Abschluss gebracht. Frau Schulz hat Microbubbles mit Doxorubicin beladen und anschließend durch eine Kombination aus Dialyse und Ionen-Austausch-Chromatographie aufgereinigt. Die erfolgreiche Beladung der Microbubbles wurde dann mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analytisch chemisch nachgewiesen.

Es schloss sich das Testen der Wirksamkeit Doxorubicin-beladener Microbubbles in 2D- (Abb. 1) und 3D-Glioblastomzellkulturmodellen an. Insbesondere die 3D-Modelle standen hierbei im Fokus der Untersuchungen.

Zum einen ist hier das SISser-Modell (dezellularisierter Schweinedarm als Matrix für Glioblastomzellen) zu nennen, zum anderen ein Bioreaktor, der in Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde (fmz, Leitung Herr Prof. J. Groll), Universitätsklinikum Würzburg verwendet werden konnte. Glioblastomzellen werden hierbei in einem Hydrogel eingebettet, durch das ein perfundierbarer Kanal hindurchführt, wodurch eine Versorgung und Behandlung der Zellen gewährleistet ist. Dieses Modell simuliert ein durch den Tumor führendes Blutgefäß, durch welches die Microbubble-Suspension geleitet wurde.

In allen Modellen erfolgte die Behandlung der Zellen mit aufgereinigten, mit Doxorubicin beladenen Microbubbles und fokussiertem Ultraschall niedriger Intensität. Es konnte dabei beobachtet werden, dass die Microbubbles unter Ultraschallapplikation zerplatzen und den Wirkstoff Doxorubicin freisetzen. Die Aufnahme des fluoreszierenden Chemotherapeutikums durch die Glioblastomzellen konnte mit dem Fluoreszenzmikroskop bestätigt werden. Zur Analyse der Wirksamkeit der Microbubbles wurden immunhistochemische Färbungen durchgeführt. So konnte durch die Verwendung eines Antikörpers gegen γH2AX, welcher die durch Doxorubicin verursachten DNA-Doppelstrangbrüche markiert, indirekt die Apoptose (Zelltod) nachgewiesen werden (Abb. 2). Eine statistische Analyse bestätigte die hohe Wirksamkeit der Microbubbles in Kombination mit

fokussiertem Ultraschall und das Absterben der Tumorzellen. Auch die Ergebnisse aus dem Bioreaktor-3D-Modell bestätigten die oben genannten Befunde (Abb. 3).

Des Weiteren wurde die Kultivierung hippocampaler Brain Slice Kulturen aus der Maus fortgesetzt und erweitert. Es ist jetzt gelungen, Mikrotumoren aus bereits etablierten Glioblastomzelllinien als auch aus patienteneigenem, intraoperativ entferntem Material auf diesen Hirnschnitten dreidimensional zu kultivieren. Neben diesen aus Mäusen stammenden Hirnschnitten, konnte Frau Schulz auch Hirnschnitte aus frischem Glioblastommaterial herstellen und über mehrere Tage kultivieren. Letzteres wird es zukünftig ermöglichen, die Wirksamkeit von Therapeutika, wie z.B. Microbubbles, direkt am Patiententumor im Labor zu testen. Als Proof-of-Principle wurde eine bereits etablierte Behandlungsmethode, sogenannte Tumor Treating Fields (TTFields), auf dieses 3D-Modell erfolgreich angewendet.

Insgesamt stellen die in 2021 generierten Daten einen großen Erfolg dar und bringen mit Beendigung des 3. Arbeitspaketes des Antrages das Projekt experimentell zum Abschluss. Derzeit wertet Frau Schulz die Gesamtdaten endgültig aus und bereitet sie für die Publikation in Fachzeitschriften und für ihre Promotionsarbeit auf. Drei wissenschaftliche Manuskripte stehen kurz vor dem Abschluss, so dass sie zeitnah bei Fachjournalen zur Begutachtung und Veröffentlichung eingereicht werden können und im Laufe des Jahres 2022 erscheinen sollten. Sobald dies geschehen ist und Frau Schulz ihre Dissertation erfolgreich verteidigt hat, kann die Planung und Beantragung eines Tierversuches begonnen werden, um die Anwendbarkeit Zytostatika-beladener Microbubbles auch im lebenden Organismus zu zeigen. Dies wäre dann ein Fortsetzungsprojekt, welches in den nächsten Jahren zu bearbeiten sein wird.

Während des Förderzeitraums betreute Abschlussarbeiten:

• Dr. rer. nat. Viviane Mawamba Kemo: Beladung von Microbubbles mit Platin(II)- oder Palladium(II)-Komplexen und Freisetzung unter Einwirkung von Ultraschall zur Behandlung von Glioblastomen Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Studiengang Chemie, 30.10.2020

• B.Sc. Clara Keller: Nachweis von apoptotischen Glioblastomzellen in einem 3D-Zellkulturmodell mittels immunhistochemischer Fluoreszenzfärbung. Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Studiengang Biochemie, 02.03.2021 (Note: 1,0)

• B.Sc. Jonathan Hiltensberger: Nachweis der Wirkung von Doxorubicin auf Glioblastomzellen mittels immunhistochemischer Fluoreszenzfärbung im 2D und 3D Zellkulturmodell. Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Studiengang Biologie, 12.07.2021 (Note: 1,7)

• Ellina Schulz: Lokale Ultraschall-vermittelte Zytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren: Von der Zellkultur zum Tierversuch. Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Studiengang Biologie, Dissertation in Vorbereitung.

Kongressbeiträge aus dem geförderten Projekt:

• Schulz, E.; Mawamba, V.; Sturm, V.; Ernestus, R.-I.; Schatzschneider, U.; Löhr, M.; Hagemann, C.: Chemotherapeutika-beladene Microbubbles – eine vielversprechende Zukunftsstrategie zur Behandlung maligner Gliome. 70. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurochirurgie (DGNC); Würzburg, 12.-15.05.2019. (Vortrag)

• Schulz, E.; Mawamba, V.; Sturm, V,.; Ernestus, R.-I.; Schatzschneider, U.; Löhr, M.; Hagemann, C.: Treatment of malignant gliomas with drug-loaded microbubbles: A promising future therapeutic strategy. Brain Tumor 2019; Berlin, 23.-24.05.2019. (Posterpreis, 2. Platz)

• Schulz, E.; Mawamba, V.; Sturm, V.; Ernestus, R.-I.; Schatzschneider, U.; Löhr, M.; Hagemann, C.: Conception of a promising future therapy: Drug-loaded microbubbles against glioblastoma. 14th Meeting of the European Association of Neuro-Oncology (EANO); Lyon, Frankreich, 19.-22.09.2019. Neuro-Oncology 21, 2019, Suppl. 3, iii53.

• Schulz, E.; Keller, C.; Nietzer, S.; Ernestus, R.-I.; Löhr, M.; Hagemann, C.: Serosa als in vitro 3D-Modell für Medikamententests zur Behandlung von Glioblastoma multiforme. 72. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurochirurgie (DGNC) digital, 06.-09.06.2021

• Schulz, E.; Dufner, V.; Monoranu, C.; Diener, L.; Löhr, M.; Ernestus, R.-I.; Hagemann, C.: 3D-in vitro-Modelle zur Evaluation von Tumor Treating Fields Effekten auf Glioblastom-Gewebe von Patienten. 23. NOA Jahrestagung der Neuroonkologischen Arbeitsgemeinschaft. Frankfurt am Main, 07.-08.10.2021

Publikationen aus dem geförderten Projekt:

• Peng, K.; Mawamba, V.; Schulz, E.; Löhr, M.; Hagemann, C.; Schatzschneider, U.: iClick reactions of square-planar palladium(II) and platinum(II) azido complexes with electron-poor alkynes: Metal-dependent preference for N1 vs. N2 triazolate coordination and kinetic studies with 1H and 19F NMR spectroscopy. Inorg. Chem. 2019, 58, 11508-11521 (doi: 10.1021/acs.inorgchem.9b01304) (IF: 4,85)

• Schulz, E.; Hohmann, T.; Hohmann, U.; Ernestus, R.-I.; Löhr, M.; Dehghani, F.; Hagemann, C.: Preparation and culture of organotypic hippocampal slices for the analysis of brain metastasis and primary brain tumor growth. In: Stein, U. (ed.), Metastasis: methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, vol. 2294, Springer Nature 2021 (doi: 10.1007/978-1-0716-1350-4_5) (IF: -)

• Dufner, V.*; Schulz, E.*; Salvador, E.; Trautmann, L.; Diener, L.; Monoranu, C.M.; Dehghani, F.; Ernestus, R.-I.; Löhr, M.; Hagemann, C.: Brain tumor derived 3D ex vivo models to evaluate TTFields effects and efficacy. In Vorbereitung. (* gleichberechtigte Erstautorschaft)

• Schulz, E.; Mawamba, V.; Löhr, M.; Hagemann, C.; Friedrich, A.; Schatzschneider, U.: Structure-activity relations of Pd(II) and Pt(II) thiosemicarbazone complexes on different Glioblastoma cell lines. In Vorbereitung.

• Schulz, E.; Keller, C.; Hiltensberger, J.; Blum, C.; Nietzer, S.; Löhr, M.; Ernestus, R.-I.; Schatzschneider, U.; Hagemann, C.: Evaluation of Doxorubicin loaded microbubbles in combination with low intensity focused ultrasound as a novel drug delivery system for glioblastoma therapy. In Vorbereitung.

Ich möchte diesen Projekt-Abschlussbericht mit meiner tiefsten Dankbarkeit gegenüber der Jörg-Bernards-Stiftung abschließen, deren extrem großzügige Förderung die Bearbeitung eines solch komplexen und innovativen Themas überhaupt erst ermöglicht hat.

Würzburg, 31.01.2022

Prof. Dr. Carsten Hagemann

Die Jörg-Bernards-Stiftung finanziert seit Januar 2018 sehr großzügig das Projekt „Lokale Ultraschall-vermittelte Zytostatika-Applikation zur Behandlung von Hirntumoren: Von der Zellkultur zum Tierversuch“. Obwohl von Beginn der Finanzierung im Januar an Arbeiten vor allem in der Arbeitsgruppe Bioanorganische und Medizinische Anorganische Chemie des Instituts für Anorganische Chemie (Prof. Dr. Schatzschneider) durchgeführt wurden, konnte das Projekt erst mit der Einstellung der Biologie-Doktorandin Ellina Schulz im Mai 2018 richtig Fahrt aufnehmen. Frau Schulz ist jetzt seit 1,5 Jahren auf dem auf 3 Jahre angelegten Projekt tätig, so dass sich eine Halbzeitbilanz anbietet. In Abbildung 1 ist das Arbeitsprogramm aus dem Projektantrag dargestellt.

In der Chemie wurden Versuche zur Lagerfähigkeit der Microbubbles durchgeführt (Arbeitspaket 4). Diese stellte sich leider als eher gering heraus, da die Microbubbles sich

nach wenigen Stunden von alleine zersetzen. Dies bedeutet, dass die Microbubbles vor ihrer Verwendung immer frisch synthetisiert werden müssen. An einer Verbesserung der Bubblestabilität wird derzeit gearbeitet. Die Beladung mit verschiedenen Wirkstoffen gelingt dagegen recht gut.

Es wurden auch weitere Platin- und Palladiumverbindungen synthetisiert und dann in der Tumorbiologie an Glioblastomzellen getestet (Arbeitspaket 1, Abbildung 2). Erste Daten aus diesem Projektteil wurden in diesem Jahr in der angesehenen wissenschaftlichen Zeitschrift „Inorganic Chemistry“ publiziert: „Peng, K.; Mawamba, V.; Schulz, E.; Löhr, M.; Hagemann, C.; Schatzschneider, U.: iClick reactions of square-planar palladium(II) and platinum(II) azido complexes with electron-poor alkynes: Metal-dependent preference for N1 vs N2 triazolate coordination and kinetic studies with 1H and 19F spectroscopy. Inorganic Chemistry 2019; 58, 17: 11508-11521. (doi: www.doi.org/10.1021/acs.inorgchem.9b01304).” Selbstverständlich wird der Förderung durch die Jörg-Bernards-Stiftung in der Danksagung (Acknowledgements) an erster Stelle gedankt. Eine zweite Publikation ist derzeit in Vorbereitung.

Wie auch aus der oben genannten Publikation hervorgeht, sind die Ergebnisse sehr vielversprechend. Die Wirksamkeit der neuen Verbindungen gegenüber Glioblastomzellen wurde in Viabilitätsassays (MTT-Assay) überprüft. Hier wiesen mehrere Verbindungen niedrige EC50-Werte auf, was auf eine hohe Wirksamkeit gegenüber Glioblastomzellen schließen lässt. Abbildung 2 zeigt das Beispiel einer dieser neuen Substanzen.

Um die Beladung der Microbubbles mit Substanzen besser visualisieren zu können, wurden sie mit Curcumin beladen. Curcumin wird als Therapeutikum gegen verschiedene Tumorentitäten diskutiert. Sein Vorteil ist aber, dass es nicht toxisch ist, eine gelbliche Färbung aufweist und zusätzlich noch eine Autofluoreszenz besitzt. Zerplatzen die Microbubbles mit dem fluoreszierenden Curcumin nach Ultraschallbehandlung, müsste dieses von den Zellen aufgenommen werden und dieser Vorgang sollte dann durch die Fluoreszenz zu einem frühen Zeitpunkt in den Zellen mikroskopisch nachgewiesen werden können. Leider hat dieser Versuchsansatz nicht zum Erfolg geführt, da sich das Löseverhalten, als auch die Messung der Quantität als sehr schwierig erwiesen hat. Aber auch die Erkenntnis, dass etwas nicht wie erwartet funktioniert, ist sehr wichtig und bringt das Projekt voran. Eine Alternative ist nun die Beladung der Microbubbles mit dem grün fluoreszierenden Paclitaxel, ein in der Klinik gängiges Chemotherapeutikum. Erste Vorversuche zur Verfahrensoptimierung laufen derzeit. Dabei ist geplant, verschiedene Methoden zur Viabilitätsbestimmung einzusetzen. Als Beispiel wäre hier der TUNEL-Assay zu nennen, mit dem man durch Paclitaxel ausgelösten sogenannten programmierten Zelltod (Apoptose) nachweisen kann.

Die Effekte der Microbubbles und verschiedener Substanzen können aber auch in Echtzeit mit dem xCELLigence System gemessen werden (Meilenstein 1). Die Methode wurde von Frau Schulz etabliert und optimiert, so dass sie nun für zukünftige Versuche verwendet werden kann. Des Weiteren hat Frau Schulz im Laufe des vergangenen Jahres eine Methode etabliert, um lebende Zellen von toten Zellen zu unterscheiden. Hierfür führt sie eine sogenannte Lebend-Tot-Färbung durch. Mit speziellen Farbstoffen gelingt es ihr, lebende Zellen grün und tote Zellen rot darzustellen. Die Auswertung erfolgt am Mikroskop. Diese Methode dient als Grundlage um den Erfolg der mit Chemotherapeutika beladenen Microbubbles an den Zellen zu Testen (Meilenstein 2). Zerplatzen die Microbubbles und setzen den Wirkstoff frei, so werden die Zellen abgetötet und lassen sich nach einem bestimmten Zeitraum rot anfärben, bevor sie sich ablösen. Ein Beispiel ist in Abbildung 3 gezeigt.

Im Zentrum von Arbeitspaket 2, welches wie geplant dieses Jahr angelaufen ist, steht der Transfer der Experimente von einfachen 2D-Gewebekulturen, wie sie oben beschrieben wurden, auf anspruchsvolle 3D Tumormodelle. Hierfür wurden Hirnschnitte von Mäusen angefertigt und erfolgreich in Kultur genommen (Brain Slice Kulturen). Diese Kulturen sind sehr anspruchsvoll, so dass langwierige Etablierungs- und Optimierungsexperimente durchgeführt werden müssen. Es ist Frau Schulz gelungen, erste Kulturen über längere Zeit am Leben zu erhalten, wie man gut in Abbildung 4 an der Lebend-Tot-Färbung erkennen kann.

Der nächste Schritt wird nun sein, diese Brain Slice Kulturen mit Glioblastomzellen anzuimpfen und die entstehenden Mikrotumoren dann mit Microbubbles zu behandeln. Die erwarteten Effekte sollen mittels immunhistochemischer Fluoreszenzfärbungen visualisiert werden. Als Vorbereitung auf diese zukünftigen Experimente wurden bereits 7μM dicke Gefrierschnitte von den Brain Slice Kulturen angefertigt und Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt um die Blutgefäße anzufärben (Abbildung 5).

Obwohl es im Laufe des letzten Jahres auch Rückschläge gab und z.B. das Zellkulturlabor wegen eines Kontaminationsproblems für mehrere Wochen geschlossen werden musste, liegt das Projekt derzeit perfekt im Zeitplan. Arbeitspaket 1 und Meilensteine 1 und 2 wurden fristgerecht abgeschlossen, mit Arbeitspaket 2 wurde begonnen und es macht gute Fortschritte. Für das Jahr 2020 steht nur die Weiterführung der Experimente mit dem Brain Slice Modell an und die Übertragung der Experimente in die 3D-Bioreaktoren des Tissue Engineering. Die geplante Anpassung des Ultraschalltransducers kann erst erfolgen, wenn die 3D-Zellkulturmethoden stehen und reproduzierbar etabliert wurden (Arbeitspaket 3). Dies ist für Mitte 2020 geplant.

Im Jahre 2019 standen auch einige Konferenzen und Öffentlichkeitsarbeit an. So hielt Frau Schulz im Mai einen Vortrag auf der jährlichen Tagung der DGNC (Deutsche Gesellschaft für Neurochirurgie) in Würzburg. Dabei konnte Sie unser Projekt vor einem renommierten Publikum, bestehend aus Neurochirurgen und Naturwissenschaftlern vorstellen, welches auch großes Interesse an dem Vorhaben zeigte. Es folgten drei weitere Konferenzen, bei denen das Projekt jeweils in Form einer Posterpräsentation in die Fach-Öffentlichkeit getragen wurde:

o Brain Tumor Meeting in Berlin (Mai)

o European Association of Neurooncology (EANO) in Lyon, Frankreich (September)

o Society of Neurooncology (SNO) in Phoenix, USA (November).

Auf allen diesen Konferenzen ist das Projekt auf reges Interesse gestoßen. Besonders erfolgreich war Frau Schulz aber in Berlin auf dem Brain Tumor Meeting, wo sie den 2. Platz beim Best Poster Award erzielte (Abbildung 6).

Auf Grund dieser Erfolge und Präsentationen wurden wir eingeladen, ein Kapitel in einem Methodenbuch zu publizieren, welches im Springer Nature Verlag zum Thema „Metastasis“ erscheinen soll. Frau Schulz wird hier als Erstautorin die Methode zur Anlage von Brain Slice Kulturen beschreiben. Zu Guter Letzt wird Frau Mawamba Anfang nächsten Jahres Ihre Doktorarbeit abschließen und einreichen.

Würzburg, 06.12.2019

Die Arbeit „Chemotherapeutika beladene Microbubbles: Eine vielversprechende Zukunftsstrategie zur Behandlung maligner Gliome“ wurde von der Programmkommision der renommierten Deutschen Gesellschaft für Neurochirurgie (DGNC) zugelassen. Diese wird daher zur 70. Jahrestagung im Rahmen eines wissenschafltichen Vortrages präsentiert. Somit ist eine weitere Wegmarke bei der Verbreitung und Anerkennung dieser Forschungsarbeit erreicht.

1. Zielsetzung

Die Entwicklung einer hochwirksamen Chemotherapie zur Behandlung von Glioblastomen (GBM) wird durch die starken systemischen Nebenwirkungen der eingesetzten zytotoxischen Substanzen und deren eingeschränkte Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu überwinden, behindert. Eine neue vielversprechende Strategie zum Transport der Therapeutika über die BHS zum Tumor könnte ihr Einschluss in Microbubbles darstellen. Dadurch wird das Medikament von den Microbubbles so abgeschirmt, dass schädliche systemische Auswirkungen vermieden werden. Ein fokussierter Ultraschall mit niedriger Intensität (LIFU) ermöglicht die kurzzeitige Öffnung der BHS und eine gezielte Freisetzung der Medikamente innerhalb des Hirntumors. Hier präsentieren wir erste Daten zur Synthese von Microbubbles und zu speziell hierfür entwickelten neuen Substanzen, sowie zur gezielten Ruptur von Microbubbles durch LIFU.

2. Methoden

Microbubbles wurden durch Dünnfilmhydratation von Lipiden hergestellt und an den GBM-Zelllinien GaMG, U87, U138 und U343 hinsichtlich ihrer Toxizität getestet. Zusätzlich wurden diese Zellen für 72 Stunden mit sechs Platin(II)- und Palladium(II)-Komplexen, die mit lipophilen Seitenketten unterschiedlicher Länge (C1, C8, C10) konjugiert sind, behandelt. Die Zelllviabilität wurde mittels MTT-Assay, sowie in Echtzeit unter Verwendung des impedanzbasierten xCELLigence DP-Systems bewertet. EC50-Werte wurden basierend auf beiden Assays berechnet.

3. Ergebnisse

Die von uns synthetisierten Microbubbles mit einem Durchmesser von ≤2 µm konnten durch LIFU zum Platzen gebracht werden. Weder die intakten Microbubbles, noch die Lipide alleine hatten eine toxische Wirkung. Im Gegensatz dazu waren alle sechs Komplexe hochwirksam. Die EC50-Werte lagen weit unter denen von Temozolomid (67 µM) und befanden sich im Bereich des EC50-Wertes des Referenztherapeutikums Cisplatin (3 µM). Insbesondere die Palladium(II)-Verbindung mit der C1-Kette wies einen sehr niedrigen EC50-Wert auf (< 10 µM), während die längeren Ketten und die Platin(II)-Verbindungen weniger effektiv waren (EC50 10 - 40 µM). Der Echtzeit-Proliferationsassay der Substanzen mit C1- und C8-Seitenketten zeigte einen frühen und konzentrationsabhängigen Beginn der zytotoxischen Wirkung, der etwa 30 Stunden nach der Anwendung einsetzte.

4. Fazit

Es wurden Microbubbles und hochwirksame Palladium(II)- und Platin(II)-Verbindungen mit niedrigen EC50-Werten synthetisiert. Ihre lipophilen Seitenketten sollten es ermöglichen, sie in die Microbubbles zu verkapseln, um so ein effektives Drug-Delivery-System für die Behandlung von GBM zu entwickeln. Die lokale Konzentration von Chemotherapeutika am Tumor könnte dann unabhängig von ihrer Molekülgröße oder BHS-Durchlässigkeit durch LIFU deutlich erhöht werden.

Allgemeines

• Januar bis April 2018: Intensive Suche nach einem/einer geeigneten Doktoranden/in.

• Einstellungen der naturwissenschaftlichen Doktorandin Frau Ellina Schulz zum 16.05.2018

• Fortführung der Zusammenarbeit mit der AG Prof. Schatzschneider (anorganische Chemie, Universität Würzburg) zur Entwicklung und Austestung von Substanzen, die zukünftig in Microbubbles integriert werden sollen, mehrere Projekttreffen im Jahresverlauf.

• Beginn des Verfassens eines ersten wissenschaftlichen Manuskriptes zusammen mit der AG Prof. Schatzschneider, welches derzeit weiter ausgearbeitet wird. Eine Publikation erster Forschungsergebnisse in einer wissenschaftlichen Fachzeitschrift ist für 2019 geplant.

• Treffen mit der AG Prof. Walles (Tissue Engineering, Universität Würzburg) am 26.07.2018: Besprechung der geplanten Zusammenarbeit zur Verwendung von 3D-Zellkulturmodellen.

• Veröffentlichung eines Presseartikels in der klinikinternen Zeitschrift „Klinikum & wir“ Nr. 3, 2018, Seite 20-21 sowie auf der Internetplattform „wuerzburgerleben“ (31.07.2018 https://www.wuerzburgerleben.de/2018/07/31/uniklinikum-wuerzburg-arbeitet-hirntumor-therapie/), in dem das Projekt allgemeinverständlich dargestellt und die Förderung durch die Jörg Bernards-Stiftung gewürdigt wird.

• Verleihung eines Forschungspreises am 03.11.2018 in Höhe von 10.196,65 EUR durch die Stiftung „Forschung hilft“ zur Förderung der Krebsforschung an der Julius-Maximilians-Universität Würzburg an die AG Dr. Hagemann/Dr. Löhr als Auszeichnung des Projektes „Mit Microbubbles gegen Hirntumoren“ als eines der besten Forschungsvorhaben.

• Einreichung eines Kongreßbeitrags mit dem Titel „Drug-loaded microbubbles: Conception of a promising future strategy against malignant gliomas“ zur Präsentation auf der 70. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurochirugie (DGNC), die vom 12.-15.05.2019 in Würzburg stattfinden wird.

• Hospitation von Frau Schulz in der AG Prof. Dehghani, Institution für Anatomie und Zellbiologie der medizinischen Fakultät der Martin Luther-Universität Halle (Saale) zum Erlernen von hippocampalen Hirnschnittkulturen am 19. und 20.11.2018. Diese werden nun von ihr bei uns im Labor etabliert und als weiteres 3D-Modell zum Austesten der Microbubbles dienen.

Labortätigkeit durch Frau Schulz:

• Austestung der in der anorganischen Chemie synthetisierten Komplexe an Glioblastomzellkulturen: DAbei handelt es sich um je 3 Platin- und Palladiumverbindungen mit unterschiedlich langen Seitenketten, die zukünftig in die Microbubbles integriert werden sollen. Zellüberlebensanalysen mittels MTT-Assay und Proliferationsechtzeitmessung mit dem xCELLigence real-time Zellanalysegerät zeigen bereits eine hohe Wirksamkeit und niedrige EC50-Werte dieser neuen Substanzen.

• Erfolgreiche Beladung der Microbubbles mit Chemotherapeutikum.

• Systematische Messung des Enflusses von fokussiertem Ultraschall auf Glioblastomzellen und Microbubbles. Letztere können durch den Ultraschall zum Zerplatzen gebracht werden.

• Beladung der Microbubbles mit dem bereits etablierten Chemotherapeutikum Paclitaxel: Erste Analyse mit dem xCELLingence System deuten auf die Wirksamkeit der beladenen Microbubbles auf Glioblastomzelllinien hin. Western-Blot Versuche weisen apopotische Zellen nach einer Behandlung mit Paclitaxel-beladenen Microbubbles nach. Eine Verifizierung dieser ersten Daten ist aktuell in Arbeit.

Würzburg, 13.12.2018

Priv.-Doz. Dr. C. Hagemann

1. Zielsetzung

Ziel des vorliegenden Projektes ist es die Wirksamkeit und Selektivität der Chemotherapie von Tumorerkrankungen, insbesondere von Hirntumoren, zu verbessern indem Zytostatika in Microbubbles eingekapselt werden die lokal durch fokussierten Ultraschall zum Platzen gebracht werden so daß der Wirkstoff nur im Tumorgewebe freigesetzt wird während eine systemische Aktivität unterbunden ist.

2. Methoden

Die Microbubbles sollen nach etablierten Methoden hergestellt und zunächst als sogenannte Dummys (ohne Zytostatika-Beladung) umfassend auf Stabilität, Größen-verteilung und Löslichkeit untersucht werden. Gängige Methoden dafür umfassen unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS) sowie die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie. Wichtige Parameter, die dabei ermittelt werden sollen sind der Einfluß von pH-Wert, Umgebungstemperatur und Licht sowie wiederholter Einfrier-/Auftau-Zyklen und Scherkräfte durch Schütteln bzw. Zentrifugieren auf die Integrität der Bubbles. Weiterhin sollten neue Wirkstoffkandidaten auf der Basis bekannter bioaktiver Platin-Verbindungen hergestellt werden die besonders einfach mit stark hydrophoben Gruppen für die Verankerung in der inneren Microbubble-Membran geeignet sind.Auf der Basis dieser Daten soll dann in weiteren Projektschritten, für die aktuell eine DFG-Sachbeihilfe beantragt ist, zunächst das toxikologische Profil der Microbubbles mit und ohne Beladung sowie der nach Ultraschall-vermittelter Ruptur verbleibenden Bubble-Bausteine untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei vor allem der Immunokompatibilität dieser mikroskaligen Systeme gelten. Darauf aufbauend sind dann erste in vivo-Studien geplant. Neben einer Demonstration der Wirkstoff-Freisetzung durchUItraschall im lebenden Modellorganismus ist es hier insbesondere auch das Ziel,Bildgebungsmethoden zur in vivo-Visualisierung und zum Tracking der Microbubbles undihrer Bestandteile zu etablieren.

4. Ergebnisse

4.1 Herstellung und Charakterisierung der Microbubbles

In der ersten Projektphase seit dem 01.03.2014 wurde im Labor von Prof. Schatzschneider zunächst die Herstellung mit Octafluorpropan gefüllter Microbubbles etabliert wobei das verwendete Verfahren hier nocheinmal in Abb. 1 gezeigt ist, für die weiteren experimentellen Details wird auf den vorherigen Bericht verwiesen.

Abb. 1: Verwendete Methode zur Herstellung der Microbubbles (nach: X. Shuai et al. Int. J. Nanomedicine 2012, 7, 895–904).

Die Microbubbles können mittlerweile sehr zuverlässig hergestellt werden, wobei derProzess im Bezug auf Größenverteilung und Langzeitstabilität optimiert wurde. Als kritisch stellte sich dabei interessanterweise insbesondere die initiale Filmherstellung heraus. Durch Anfärbung der Bubbles mit 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiIC18) konnten sehr gute Ergebnisse bei der Analyse mittels Fluoreszenzmikroskpie erzielt werden, die im Tumorbiologie-Labor der Neurochirurgischen Klinik und Poliklinik des Universitätsklinikums Würzburg (PD Dr. Carsten Hagemann) durchgeführt werden und gegenüber einfachen lichtmikroskopischen Untersuchungen ein deutlich verbessertes Bild ergeben. In Abb. 2 ist eine solche repräsentative Aufnahme gezeigt aus der vor allem die enge Größenverteilung hervorgeht.

Abb. 2: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme mit DiIC18 angefärbter Microbubbles.

4.2 Zytotoxizitätsuntersuchungen an Glioblastom-Zellen

Im Labor von Dr. Hagemann sind mittlerweile die Assays etabliert um die Zytotoxizität der verschiedenen Bubble-Komponenten sowie des Wirkstoffs mit und ohne Einschluß in die Microbubbles zu untersuchen. Dafür kommt der metabolische MTT-Assay zum Einsatz, der auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumfarbstoffs beruht, welcher von lebenden Zellen mit aktiven Mitochondrien zu einem blau-violetten Formazan reduziert wird. Die Stärke der Färbung korreliert dabei mit der Zahl der lebenden Zellen und nimmt mit der zytotoxischen Wirkung einer applizierten Substanz konzentrationsabhängig ab.Tests mit zwei Platinverbindungen, dem etablierten Antitumor-Wirkstoffs Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2) und dem bekanntermaßen inaktiven Kaliumtetrachloroplatinat (K2[PtCl4]) ergaben die erwarteten Ergebnisse und zeigen die Funktionsfähigkeit des Assays an. In einem zweiten Schritt wurden dann die Lipidbausteine der Microbubbles getestet um, obwohl erwartet, deren Unbedenklichkeit auch experimentell zu verifizieren. Im Labor von Prof. Schatzschneider arbeitet Frau Mawamba zur Zeit an der Herstellung neuer Platin-basierter Wirkstoffkandidaten mit langen, hydrophoben Alkylketten die eine Integration in die Bubble-Membran ermöglichen sollen. Erste Verbindungen stehen mittlerweile für die biologischen Tests bereit.Bis zum Jahresende soll nun ein Verfahren zur Beladung der Microbubbles mit dem organischen Wirkstoff Temozolomid etabliert werden, was insbesondere die Entwicklung einer Method zur HPLC(high-pressure liquid chromatography)-Bestimmung dieser Substanz in der Bubble-Phase und der überstehenden Lösung erfordert, während die Anlagerung Metall-basierten Wirkstoffkandidaten direkt über Messung des Platingehalts mittels ICP-MS oder AAS verfolgt werden soll.

4.3 DFG-Antrag

Basierenden auf den mit Hilfe der Förderung durch die Jörg-Bernards-Stiftung durchgeführten Vorarbeiten konnte am 30.04.2015 der Antrag auf Sachbeihilfe für das Projekt "Lokale Freisetzung zytotoxischer Wirkstoffe zur Behandlung maligner Gliome unter Verwendung von fokussiertem Ultraschall" bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) eingereicht werden. Projektverantwortliche sind PD Dr. Carsten Hagemann (Neurochirurigsche Klinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Würzburg) und Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider (Institut für Anorganische Chemie, Universität Würzburg) mit PD Dr. Mario Löhr und Prof. Dr. Volker Sturm als weiteren Mitantragstellern. In insgesamt vier Arbeitspaketen (work packages, WPs) sollen über 36 Monate Laufzeit die Bubble-Herstellung und Beladung mit Wirkstoffen (WP1), die Bubble-Stabilität und Ultraschall-vermittelte Wirkstofffreisetzung (WP2) sowie die biologische Wirkung mit und ohne Ultraschall auf Glioblastom-Zellen in in vitro 2D- und 3D-Zellkulturen (WP3+4) untersucht werden. Die Gutachten liegen der DFG mittlerweile vor und mit einer Entscheidung des zuständigen Fachkollegiums wird im 1. Quartal 2016 gerechnet.

4.4 Ausblick

Mit der erfolgreichen und reproduzierbaren Herstellung der Microbubbles sowie der Etablierung der in vitro-Zytotoxizitätsassays stehen nun prinzipiell alle Materialien und Methoden zur Verfügung um die differentielle Wirkung der beladenen Microbubbles mit und ohne Ultraschallwirkung zu untersuchen.Wesentliches Hindernis für den weiteren Projektfortschritt ist aktuell jedoch des Fehlen eines Ultraschall-Transducers mit Kosten in Höhe von ca. € 33.500,- (Angebot des Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik IBMT in St. Ingbert, Preis inkl. MwSt.). Die Mittel für dieses essentielle Gerät sind zwar in dem DFG-Antrag enthalten (vide supra), werden aber selbst bei positiver Begutachtung vermutlich frühestens Mitte 2016 zur Verfügung stehen. Zwar soll in der Zwischenzeit versucht werden die Microbubbles durch andere Mechanismen zum Platzen zu bringen (Hitzeeinwirkung, starke Scherkräfte), dabei ist jedoch mit negativen Einflüsse auf den eingeschlossenen Wirkstoff, insbesondere bei erhöhten Temperaturen, zu rechnen und das Ziel des Projekts ist ja die zytotoxische Wirkung durch fokussierten Ultraschall zu lokalisieren.Weiterhin wünschenswert wäre ein einfaches, gebrauchtes klinisches Ultraschallgerät, über das die Microbubbles über ihren differentiellen Kontrast relativ zum Medium direkt nachgewiesen werden könnte um ihre Stabilität in Modellsystemen für Blutgefäße untersuchen zu können.

5. AusgabenFür das Projekt standen auf Antrag vom 08.12.2014 im Berichtszeitraum zuzüglich der Deckung der restlichen Personalausgaben Mittel in Höhe von insgesamt € 7.500,- zur Verfügung, wobei von diesem Ansatz € 6.500,- für Sachkosten und € 1.000,- für Reisemittel vorgesehen waren.

Als verantwortliche Mitarbeiterin ist seit 01.03.2014 Frau Vivane Mawamba (Bachelor Chemie Universität Jaunde I, Kamerun; Master Chemie TU Clausthal) nach TV-L 13 50% beschäftigt, die weiterhin herausragende Arbeit leistet. Besonders hervorzuheben ist dabei die ausgezeichnete Zusammenarbeit mit den Mitarbeiter/inne/n im Labor von Herrn PD Dr. Hagemann, in dem Frau Mawamba mittlerweile regelmäßig mikroskopische Untersuchungen zur Stabilität der Microbubbles durchführt. Frau Mawamba wird seit dem 01.03.2015 über eine Hausstelle aus den Berufungsmitteln von Herrn Prof. Schatzschneider finanziert, aus der ihre Stelle bis zur einer Promotionshöchstdauer von vier Jahren weiterfinanziert wird. Im Bereich der Sachmittel wurden im wesentlichen Basischemikalien beschafft (Sigma-Aldrich, Serva und Strem: € 2.595,94-). Zudem wurden einige Ersatzteile für defekte Laborgeräte benötigt (Evoqua und HekaTech: € 1.016,86-). Weitere sächliche Auslagen an die Firma MRC Systems GmbH in Heidelberg (€ 4.424,35-) werden von Prof. Sturm separat nachgewiesen. Reisekosten fielen in 2015 nicht an da die Teilnahme von Frau Mawamba und Prof. Schatzschneider am "European Molecular Imaging Meeting" (EMIM) in Tübingen (18. bis 20.03.2015) durch die COST Action TD1004 "Theranostics Imaging and Therapy" finanziert wurde, ebenso wie die Präsentation von Prof. Schatzschneider auf dem COST TD1004 Closing Meeting in Belgrad (10./11.09.2015). Diese Mittel wurden daher zur Deckung des erweiteren Sachmittelbedarfs herangezogen. Insgesamt wird dadurch für den Projektzeitraum 01.11.2014 bis 31.03.2016 ein Fehlbetrag in Höhe von € 4.119,67- erwartet, der im wesentlichen auf die unerwarteten Auslagen für die Fa. MRC Systems zurückzuführen ist. Für einen entsprechenden Ausgleich wären wir sehr dankbar.

Würzburg, 08.11.2013

Ulrich Schatzschneider

1. Zielsetzung

Ziel des vorliegenden Projektes ist es die Wirksamkeit und Selektivität der Chemotherapie von Tumorerkrankungen, insbesondere von Hirntumoren, zu verbessern indem Cytostatika in Microbubbles eingekapselt werden die lokal durch fokussierten Ultraschall zum Platzen gebracht werden so daß der Wirkstoff nur im Tumorgewebe freigesetzt wird während eine systemische Aktivität unterbunden ist.

2. Methoden

Die Microbubbles sollten nach etablierten Methoden hergestellt und zunächst als sogenannte Dummys (ohne Cytostatika-Beladung) umfassend auf Stabilität, Größen-verteilung und Löslichkeit untersucht werden. Gängige Methoden dafür umfassen unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS) sowie die Lichtmikroskopie. Wichtige Parameter, die dabei ermittelt werden sollen sind der Einfluß von pH-Wert, Umgebungs-temperatur und Licht sowie wiederholter Einfrier-/Auftau-Zyklen und Scherkräfte durch Schütteln bzw. Zentrifugieren auf die Integrität der Bubbles. Weiterhin sollten neue Wirkstoffkandidaten auf der Basis bekannter bioaktiver Platin-Verbindungen hergestellt werden die besonders einfach mit stark hydrophoben Gruppen für die Verankerung in der inneren Microbubble-Membran geeignet sind.

Auf der Basis dieser Daten soll dann in weiteren Projektschritten, für die aktuell eine DFG-Förderung beantragt wird, zunächst das toxikologische Profil der Microbubbles mit und ohne Beladung sowie der nach Ultraschall-vermittelter Ruptur verbleibenden Bubble-Bausteine untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei vor allem der Immunokompatibilität dieser mikroskaligen Systeme gelten. Darauf aufbauend sind dann erste in vivo-Studien geplant. Neben einer Demonstration der Wirkstoff-Freisetzung durch UItraschall im lebenden Modellorganismus ist es hier insbesondere auch das Ziel, Bildgebungsmethoden zur in vivo-Visualisierung und zum Tracking der Microbubbles und ihrer Bestandteile zu etablieren.

4. Ergebnisse

Das Projekt startete am 01.03.2014 mit der Einstellung von Frau Viviane Mawamba als Doktorandin nach TVL13 50%. Sie verfügt über einen Hintergrund aus dem Bereich der bioabbaubaren Polymere und hat sich seitdem hervorragend in die Arbeitsgruppe eingefügt. Nach einer eingehenden Literaturrecherche wurde entschieden für die Synthese der Microbubbles die thin-film hydration-sonication-Method zu verwenden (Abb. 1).1 Dabei wird eine Phospholipid-Mischung (DPPC, DPPA und PEG2000-DSPE) in Chlorofom gelöst und nach Abdampfen des organischen Lösemittels ein Lipidfilm gebildet. Dieser wird dann bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (beschafft aus Projektmitteln) hydratisiert, wobei sich Liposomen bilden. Eine Suspension dieses Materials wird dann in einem Zentrifugen-röhrchen unter einer Atmosphäre von Octafluorpropan als Füllgas mit einem Ultraschall- Homogenisator (ebenfalls beschafft aus Projektmitteln) beschallt, wobei sich die Microbubbles bilden. Durch differentielle Zentrifugation können die verschiedenen Bubble- Fraktionen dann getrennt werden.2 Die Charakterisierung erfolgt im eigenen Labor mittels Lichtmikroskopie mit einer USB-Kamera zur Dokumentation sowie durch Dynamische Lichtstreuung (DLS) in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Anke Krüger ( Institut für Organische Chemie, Universität Würzburg).

Abb. 1: Verwendete Methode zur Synthese der Microbubbles (nach: X. Shuai et al. Int. J. Nanomedicine 2012, 7, 895–904).

Der Beginn der Microbubble-Herstellung wurde dabei durch die unerwartet lange Lieferzeit für die Lipide (bezogen über Distributor Otto Nordwald von Avanti Polar Lipid, Alabaster, Alabama, USA) und das Octafluorpropan (Linde Spezialgase) erheblich verzögert. Durch regelmäßiges Verwiegen insbesondere der Gasflasche wird jedoch der Verbrauch an Ausgangsmaterialien nunmehr kontinuierlich fortgeschrieben so daß in Zukunft frühzeitig Ersatz bestellt werden kann.

Für die Herstellung der Microbubbles unter Octafluorpropan-Atmosphäre wurde von Frau Mawamba ein Aufbau konstruiert der den Verbrauch an Lipiden wie an Füllgas minimiert. Bereits im ersten Versuch konnten Microbubbles erhalten werden die mit Lichtmikroskopie charakterisiert wurden. Mit dem vorhandenen Gerät (VisiScope BL224 PI mit 10 Megapixel USB-Kamera VisiCam) können dabei Bubbles bis zu einem Durchmesser von etwa 1 μm sicher identifiziert werden (Abb. 2a), für die noch kleineren Nanobubbles (d < 1 μm) reicht das Auflösungsvermögen unseres Mikroskops jedoch nichtmehr aus. Hier soll im neuen Jahr nach Markierung der Bubbles mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Dil, 1,1′-Dioctadecyl- 3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat) ein kürzlich im Labor von Dr. Carsten Hagemann (Neurochirurgische Klinik und Poliklinik, Universitäts-klinikum Würzburg) installierstes konfokales Fluoreszenzmikroskop mit wesentlich höherer Auflösung zur Charakterisierung herangezogen werden.

Als kritischer Parameter für die Isolierung der Microbubbles mit einer möglichst reproduzierbaren und engen Größenverteilung stellte sich dabei der Zentrifugationsschritt heraus. Weiterhin ergaben Messungen daß es bei der Ultraschall-Applikation im Homogenisator abhängig von Dauer und Amplitude zu einem erheblichen Energieeintrag in die Suspension kommt. So steigt bei einer Ultraschall-Applikation für nur 5 min bei einer Amplitude von 50 % die Temperatur um fast 25 °C von Raumtemperatur auf über 50 °C an. Da die Bubbles abhängig von der Temperatur "reifen" ist eine sorgfältige Kontrolle auch dieses Parameters gefragt. Möglicherweise spielt dieser auch bei dem Zentrifugations-schritt eine Rolle, da die verwendeten Rotoren über keine Temperaturkontrolle verfügen, eine Messung ist jedoch schwierig.

Abb. 2: a) Lichtmikroskopische Aufnahme der ersten im Rahmen des Projekts hergestellten Microbubbles (40fache Vergrößerung) und b) Cisplatin-Derivat mit C16-Alkylketten als Membran-affines Wirkstoffderivat.

Parallel zur Bubble-Herstellung und Charakterisierung hat Frau Mawamba auch damit begonnen, Derivate des etablierten Antitumor-Wirkstoffs Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2) herzustellen die über langkettige Alkylgruppen verfügen um so eine hohe Membran-Affinität sicherzustellen (Abb. 2b).

Trotz anfänglicher erheblicher Verzögerung die durch die lange Lieferzeit der benötigten Materialien bedingt war ist das Projekt jedoch insgesamt sehr gut gestartet. Die ein-gestellte Mitarbeiterin hat alle Erwartungen sogar noch übertroffen, sich hervorragend in das Projekt eingearbeitet und auch sehr gut in die Arbeitsgruppe eingefügt. Es wurde eine Aufbau für die Herstellung der Microbubbles konstruiert und kritische Parameter für eine reproduzierbare und enge Größenverteilung ermittelt. Die ersten hergestellten Bubbles zeigen den gewünschten Durchmesser im unteren Mikrometer-Bereich und werden nun für eine weitergehende Charakterisierung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie mit einem Farbstoff markiert. Außerdem wurden erste Schritte hin zu Membran-affinen metallbasierten Wirkstoffkandidaten unternommen. Somit konnten alle wesentlichen Projektziele erreicht werden.

In der nun folgenden Projektphase steht insbesondere die Etablierung der Zellkultur-Assays im Vordergrund sowie die Integration eines Systems für die Ultraschall-vermittelte Ruptur der Microbubbles um deren differentielle Wirkung auf Tumorzellkulturen mit und ohne Ultraschall-Einwirkung untersuchen zu können.

5. Ausgaben

Für das Projekt standen auf Antrag vom 08.11.2013 Mittel in Höhe von insgesamt € 37.500,- zur Verfügung, wobei von diesem Ansatz € 30.000,- für Personalkosten und € 7.500,- für Sachmittel vorgesehen waren.

Als Mitarbeiterin in dem Projekt wurde zum 01.03.2014 Frau Vivane Mawamba (Bachelor Chemie Universität Jaunde I, Kamerun; Master Chemie TU Clausthal) eingestellt die mit einem Hintergrund aus dem Bereich bioabbaubare Polymere über den passenden Hintergrund für das Vorhaben verfügt und sich seitdem hervorragend in die Arbeitsgruppe eingefügt hat. Die Personalkosten für die Monate März bis Oktober 2014 beliefen sich auf € 16.701,20- was bei einer Laufzeit von acht Monaten einem Betrag von € 2.087,65- pro Monat entspricht. Für die gesamte Projektdauer werden daher Personalausgaben in Höhe von € 25.051,80- zzgl. der Jahressonderleistung in Form von Weihnachtsgeld erwartet und der Personalansatz somit vermutlich geringfügig unterschritten. Frau Mawamba wird ab 01.03.2015 über eine Hausstelle aus den Berufungsmitteln von Herrn Prof. Schatzschneider bis zur einer Promotionshöchstdauer von 4 Jahren weiterfinanziert werden.

Im Bereich der Sachmittel waren für die Herstellung der Microbubbles insbesondere die Beschaffung eines Schüttelinkubators (VWR: € 1.431,57-) und eines Ultraschall-Generators (Zinsser Analytics: € 3.263,81-) erforderlich. Weitere wesentliche Positionen stellten die Lipide für das Microbubble-Hüllmaterial (Avanti Polar Lipids durch Distributor Otto Nordwald: € 733,04-) und als Microbubble-Füllmaterial Octafluorpropan (Linde Spezialgase: € 956,28-) dar. Der Restbetrag verteilte sich dann auf weiteres Laborkleingerät sowie Basischemikalien (VWR, Sigma und Hartenstein: € 1.065,00-). Weitere sächliche Auslagen an die Firma MRC Systems GmbH in Heidelberg (€ 6.417,88-) werden von Prof. Sturm separat nachgewiesen.

Reisekosten fielen in 2014 nicht an da die Teilnahme von Frau Mawamba an dem COST Action TD1004 "Theranostics Imaging and Therapy" Annual Meeting in Istanbul (03. und 04.10.2014), an dem sie sich einen Vortrag zum Thema "Microbubbles as drug carriers" beteiligt hat, und der 3. NanoFar Autumn School an der Université catholique de Louvain in Brüssel (20.–24.10.2014) dankenswerterweise von COST TD1004 erstattet wurden. Diese Mittel wurden daher zur Deckung des erweiteren Sachmittelbedarfs herangezogen.

Insgesamt wird so für die Projektlaufzeit 01.03.2014 bis 28.02.2015 ein Fehlbetrag in Höhe von € 1.419,38- zzgl. des Betrags für die Weihnachtssonderzahlung, voraussichtlich insgesamt € 2.500,- erwartet, der im wesentlichen auf die unerwarteten Auslagen für die Fa. MRC Systems zurückzuführen ist. Für einen entsprechenden Ausgleich wären wir sehr dankbar.

Würzburg, 08.11.2013

Ulrich Schatzschneider

Um die Wirkung der Mikrobubbles auf Krebszellen mit und ohne Wirkstoff-Beladung sowie Einwirkung von Ultraschall untersuchen zu können ist eine Vielzahl von Arbeitsschritten notwendig. Mit Hilfe eines kürzlich beschafften xCELLigence Real-time Cell Analysis-Systems der Firma Acea Biosciences konnten diese Schritte erheblich vereinfacht werden und erlauben es nun, das Zellwachstum auch in Echtzeit zu verfolgen.

Im Tumorbiologie-Labor des Universitätsklinikums Würzburg in Kooperation mit dem Institut für Anorganische Chemie der Universität Würzburg

Einen Einblick in typische Arbeitsschritte im Tumorbiologie-Labor der Universität Würzburg geben die beiden Fotos oben. Links analysiert der Biochemie-Student Wilfrid Dzokou auf dem Laptop Wachstumskurven von Krebszellen für seine Bachelorarbeit während rechts die Technische Laborassistentin Elisabeth Karl das xCELLigence-Gerät mit neuen Zellkulturplatten belädt. Anschließend wird die Tür des Brutschranks geschlossen um die Zellen unter konstanten Bedingungen, insbesondere bei 37 °C wie im menschlichen Körper, wachsen zu lassen.

Unten das Projektteam (von links nach rechts): Viviane Mawamba, Doktorandin am Institut für Anorganische Chemie, Prof. Dr. Ulrich Schatzschneider, Leiter chemische Synthese und Microbubble-Herstellung, Priv.-Doz. Dr. Carsten Hagemann, Leiter des Tumorbiologie-Labors, Priv.-Doz. Dr. Mario Löhr und Prof. Dr. Volker Sturm, Leitung des ärztlichen Teams.

Elektronisch angesteuerte Transducer-Elemente erlauben die Fokussierung des Ultraschalls auf den Tumor

Durch sogenannte "phased array transducer", wie sie auch in der modernen Radartechnik zum Einsatz kommen, kann der Ultraschall alleine durch elektronische Ansteuerung der Transducer-Elemente in bestimmte Richtungen gelenkt werden. Für therapeutische Anwendungen ist daher geplant die Transducer in einem Helm zu fixieren so daß ihre Anordnung relativ zum Tumor auch bei Kopfbewegungen des Patienten konstant bleibt. Anhand von Tomographie-Bildern wird dann festgelegt welche Gehirn-Bereiche wie lange und wie intensiv dem fokussierten Ultraschall ausgesetzt werden sollen um die im Blutstrom zirkulierenden Microbubbles zum Platzen zu bringen und den enthaltenen Wirkstoff lokal freizusetzen. Dabei werden auch Unregelmäßigkeiten in der Struktur des Schädelknochens berücksichtigt.Anders als beispielsweise radioaktive Strahlung ist Ultraschall gesundheitlich unbedenklich und hat keinen schädlichen Einfluss auf das ebenfalls durchstrahlte gesunde Gewebe. Der verwendete Ultraschall ist dabei sehr ähnlich dem schon seit langem z.B. bei Schwangerschaftsuntersuchungen verwendeten.Die Abbildung zeigt die Aufnahme eines Gehirntumors (weiß umrandete Fläche in der oberen linken Kopfhälfte) mit der schematischen Darstellung zweier Transducer-Elemente und unterschiedlich abgestrahltem Ultraschall.

Ultraschall-Behandlung bringt die Microbubbles zum Platzen und verwandelt die milchige Suspension in eine klare Lösung

Ultraschall bringt die Microbubbles zum Platzen

Die Abbildung zeigt eine Suspension der Microbubbles in wässriger Lösung (links) vor und (rechts) nach Beschallung mit Ultraschall. Die Bubbles sind zu klein um sie ohne Mikroskop mit dem bloßen Auge erkennen zu können, ihre Lösungen erscheinen jedoch milchig, ganz wie bei Kuhmilch, die ebenfalls aus Fetttröpfchen in Wasser besteht.

Durch die Einwirkung des Ultraschalls zerplatzen die Bubbles und zerfallen in ihre Bestandteile, die zu klein sind um noch Licht zu streuen. Daher ist die Ultraschall-behandelte Lösung klar.

Mit einem Farbstoff markierte Microbubbles leuchten im Mikroskop und lassen die Bläschen erkennen die 50x kleiner sind als der Durchmesser eines menschlichen Haars.

Die Abbildung zeigt Microbubbles in deren Hülle ein Fluoreszenz-Farbstoff eingebettet ist. Dieser beginnt beim Anstrahlen im Mikroskop zu leuchten und macht so die Bläschen sichtbar.

Mit einem Durchmesser von nur etwa einem Mikrometer (1 µm) sind die Microbubbles etwa 50x dünner als der Querschnitt eines menschlichen Haars und damit so klein daß sie auch durch die Kapillargefäße des menschlichen Blutkreislaufs wandern können ohne diese zu verstopfen.

Die Hülle der Microbubbles besteht aus Lipid-Bausteinen ähnlich der Wand menschlicher Zellen und ist daher ebenso wie das Füllgas gesundheitlich unbedenklich. Nach dem Zerplatzen der Bubbles wird das ohnehin nur in geringsten Mengen aufgenommene Füllgas vermutlich über die Lungen wieder abgeatmet.

In die lipophile, fettartige Hülle der Microbubbles können medizinische Wirkstoffe eingelagert werden, die so vor unspezifischen negativen Wechselwirkungen mit dem Körper geschützt sind, was die bekannten Nebenwirkungen einer Chemotherapie lindern soll. Erst im Tumor soll das Medikament dann durch Ultraschall-vermitteltes lokalisiertes Zerplatzen der Bubbles freigesetzt werden und seine Wirkung entfalten.

Microbubbles und ihre Bausteine sind biologisch unbedenklich, Platin-basierte Wirkstoffe töten dagegen Krebszellen ab

Die biologische Wirkung einer chemischen Verbindung kann durch den MTT-Assay gemessen werden. Dieser beruht darauf daß lebende Zellen einen gelben Farbstoff zu einer violetten Verbindung reduzieren. Je weniger stark violett eine Zellkultur ist desto weniger lebende Zellen enthält diese, was in der Regel auf einer Skala von 0 bis 1 (entsprechend 0–100%) relativ zu unbehandelten Zellen angeben ist.

Die Abbildung zeigt a) die vernachlässigbare Wirkung der Lipid-Bausteine (DPPA, DPPC, DSPE-PEG) der Microbubbles relativ zu eine Kontrollprobe sowie b) die gewünschte Inaktivität der intakten Microbubbles bis zu einer Millionen Bläschen pro Milliliter. Demgegenüber führt eine Behandlung mit c) Cisplatin, ein in der Chemotherapie insbesondere von Hodenkrebs sehr erfolgreich eingesetzter Wirkstoff, zu einer signifikanten Reduktion der Zahl der lebenden Zellen. Da Cisplatin nicht lipophil genug ist um in die Hülle der Microbubbles eingebaut zu werden wurde d) eine weitere experimentelle Substanz VM-046-01 hergestellt die über einen seifenartigen "Schwanz" verfügt mit dem sie sich an die Bubbles anlagern soll und die ebenfalls wirksam gegen die Hirntumorzellen ist.

Projektziele:

Die Untersuchungen wurden bisher ausschließlich aus Zuwendungen der Jörg Bernards-Stiftung, sowie aus Eigenmitteln der Klinik für Neurochirurgie des Universitätsklinikums und des Instituts für Anorganische Chemie der Universität Würzburg finanziert.

Die oben skizzierten Zwischenergebnisse sind positiv. Die für den bisherigen Projektverlauf avisierten Ziele sind erreicht. Wir sehen damit gute Chancen, in den nächsten 2 bis 3 Jahren eine zumindest im Tierversuch einsetzbare Methodik zur verbesserten, d.h. lokalen Chemotherapie bösartiger Hirntumoren, sowie im nächsten Schritt auch bestimmter anderer Krebserkrankungen wie Mamma- und Prostatakarzinomen zu entwickeln. Dier hierzu notwendigen chemischen und biologischen Experimente können mit überschaubaren Mitteln realisiert werden. Dies schließt die Entwicklung und Anwendung einfacher, allerdings nur in Laborversuchen verwendbarer Ultraschall-Systeme ein. Ein wesentliches Zwischenziel war die aus Stiftungsmitteln finanzierte Konstruktion des bislang verwendeten Ultraschall-Systems, das für die weiterführenden Versuche noch modifiziert werden muss.

Ziel ist der erfolgreiche Abschluss der chemischen und biologischen Entwicklungen, d.h. die Demonstration der erhöhten Wirksamkeit und Verträglichkeit des neuen Verfahrens.

Nach der Ablehnung des vom DKFZ Heidelberg koordinierten interdisziplinären Projektes zur Entwicklung eines klinisch einsetzbaren Ultraschall-Systems ist es sehr fraglich, ob dieses Ziel erreichbar ist. Wir werden diese Problematik mit den Projektteilnehmern (insbesondere DKFZ Heidelberg und Fraunhofer Institut St. Ingbert und Kaiserslautern) diskutieren. Sollte dieses Projekt nicht finanzierbar sein, müsste das von uns in Würzburg entwickelte Verfahren industriellen Partnern zur Verfügung gestellt werden, um die Einführung in die Klinik zu ermöglichen.

Für eine weitere Förderung des Würzburger Projektes wären wir sehr dankbar. Eine Abschätzung des Finanzbedarfes werden wir in Kürze nachreichen.